一、研究背景:CD69曾被称为活化诱导分子AIM、Leu23、早期激活抗原EA1、MLR3,其基因分别位于小鼠6号染色体及人12号染色体长臂的自然杀伤细胞(NK)基因复合体,小鼠CD69分子的遗传学及生物学特征与人的同源物很相似。CD69分子属于C型凝集素样超家族NK细胞膜受体,通过二硫键连接成同源二聚体,该二聚体属于II型跨膜蛋白。成熟CD69分子由199个氨基酸残基组成,胞浆区有38个氨基酸残基,含丝/苏氨酸激酶磷酸化位点,此位点组成型磷酸化。在CD69分子胞膜外区的C末端有糖基识别位点,可能参与CD69分子识别病原体。CD69是炎症反应中白细胞的最早期活化标志,迅速并暂时性表达在活化淋巴细胞表面,淋巴细胞活化后1到2小时内即有表达,18-24小时可达到高峰。CD69广泛表达在除红细胞外的髓系细胞上(包括肥大细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞等),组成性表达在血小板、成熟胸腺细胞和前体淋巴细胞上,还表达在外周淋巴器官的部分淋巴细胞上,但在外周血淋巴细胞及静息淋巴细胞上不表达。大多数时候CD69被看作一种淋巴细胞活化性标记,在细胞活化后表达上调,然而目前的研究表明,CD69在体内不单纯作为一种活化性或抑制性分子,而是更倾向于作为辅助信号或者协同刺激信号参与免疫应答。譬如,肥大细胞通过FcεRI介导肿瘤坏死因子TNF分泌,在此过程中,CD69与抗CD69抗体结合后能增强肥大细胞分泌炎症介质的作用,而单独CD69抗体不能有效刺激肥大细胞分泌TNF。PMA活化人外周血T淋巴细胞表达CD69,在活化型抗CD69单克隆抗体存在的情况下能促进T细胞增殖,而单独CD69抗体或单独PMA作用时均不能诱导T细胞显著增殖。可能是佛波醇酯PMA激活了蛋白激酶C途径,CD69分子与配体结合后能增强该通路的效应。这些实验结果表明,CD69分子必须在某种刺激存在的前提下,对该刺激起到协同作用。CD69分子不仅能够辅助活化性信号,在抑制型信号的产生和功能中也起到不可忽视的作用。早期研究认为CD69是表达在不同白细胞表面的活化性标记,因而称之为活化诱导分子(AIM),而最近的研究发现,CD69通过介导细胞分泌TGF-β1也能下调免疫反应。尽管活化早期即表达CD69,但早期T细胞的活化和增殖并不必需要有CD69的参与,或者说CD69不起决定性作用,这一观点在CD69-/-小鼠模型中可以得到证实: CD69 KO小鼠的T淋巴细胞发育正常,在各种刺激剂作用下表现出同野生型小鼠同样的增殖能力,T细胞和NK的杀伤功能也未受到影响。然而CD69却有可能在T细胞活化后的分化过程中表现出重要的作用,CD69分子能够促进免疫调控因子TGF-β1的合成,通过该途径负向调控免疫应答反应,该观点在体内及体外试验中均已得到证实。在CD69缺陷小鼠体内诱导出的关节炎CIA模型及NK敏感性肿瘤模型均表现出免疫反应增强,并且这种增强与特异性免疫效应细胞或天然免疫相关细胞合成TGF-β1减少有关,体外试验也已证实与活化型抗CD69抗体结合后,CD69~+细胞(T细胞、NK细胞、巨噬细胞)能分泌TGF-β1。CD69究竟介导免疫系统活化还是抑制似乎与具体的靶细胞和微环境病理信号有关。虽然CD69的体内相应配体尚未发现,但CD69在体内参与负向免疫调控的作用正日益受到关注。二、科学问题的提出:尽管以往公认CD69是T细胞和NK细胞活化性标志,但是近年来的研究表明CD69分子参与了肿瘤免疫逃逸过程。T细胞介导的细胞免疫应答在肿瘤免疫中起着极其重要的作用,大量研究表明CD4~+ T细胞参与抗肿瘤免疫应答反应,此外,某些CD4~+ T细胞亚群如CD4~+CD25~+ T细胞则可以负相调控抗肿瘤免疫应答反应。鉴于此,我们提出的科学问题是:CD4~+ T细胞是否存在新的亚群如CD4~+CD69~+ T细胞亚群,如果存在,该CD4~+CD69~+ T细胞亚群在肿瘤发生发展过程中及免疫应答调控中发挥着什么作用?其相关的作用机制是什么?三、研究结果:针对上述的科学问题,我们开展了相应的研究,首先观察到肿瘤发生与免疫细胞相互作用中CD4~+CD69~+ T细胞亚群确实存在并伴随肿瘤发展有逐渐升高的趋势,基于此现象,我们进行了以下实验并得到如下结果: 1)复制3LL肺癌、Hepa肝癌、B16黑色素瘤等原位小鼠肿瘤模型,分析脾脏淋巴细胞中CD4~+CD69~+ T细胞的数量以及表型变化,并检测其分泌细胞因子的情况。我们发现在CD4~+NKI.I-的细胞群中,CD4~+CD69~+ T细胞占CD4~+NKI.I-细胞的比例伴随肿瘤进展从3-6%上升至12-50%,该细胞亚群表型为CD25~+CD122~+;通过FACS胞内染色和ELISA检测表明新鲜分离的该细胞亚群细胞因子诸如IL-4、IL-10、IFN-γ和TGF-β1的分泌情况与CD4~+CD69- T细胞相比无显著差异。2)为进一步检测其功能,我们用已建株的脾脏基质细胞107B模拟体内免疫器官微环境(我们以往曾经证明此基质微环境能够诱导负相调控作用的调控性树突状细胞的产生, (Zhang M et al: Nat Immuno, 2004)),将CD4~+CD69~+ T细胞与基质细胞共培养,但FACS胞内染色和ELISA检测并未得到阳性结果;由于CD69分子的相应配体尚未找到,目前国际上对CD69分子的研究都采用其活化型抗体作为CD69体外研究的刺激剂,因此我们用活化型CD69抗体体外刺激纯化后的CD4~+CD69~+ T细胞,FACS胞内染色和ELISA检测也未得到任何阳性结果。对CD69分子的以往研究认为CD69并不单纯是某种活化型或抑制型受体,它的表达更倾向于作为共刺激分子发挥作用,因此,我们在基质细胞与CD4~+CD69~+ T细胞的共培养体系中同时加入活化型CD69抗体刺激,通过胞内染色和ELISA检测发现,CD4~+CD69~+ T细胞能够分泌TGF-β1,提示该细胞亚群在体内可能具有抑制性调节功能。3)以往文献和前期实验结果均证实在多种病理环境下(肿瘤、感染、免疫刺激剂作用后、器官移植),脾脏、骨髓以及肿瘤浸润部位存在一种免疫抑制细胞MSCs(Myeloid suppressor cells,髓系来源的抑制细胞),它同时拥有成熟与不成熟的髓系表型,这群细胞公认的表型为Gr-1和CD11b双阳性,它与肿瘤发展伴行,功能上具有促进肿瘤增长、抑制T细胞免疫应答反应的作用。因脾脏基质细胞株107B是经体外长期传代培养后已建株的细胞,可能与体内微环境尚有差距,我们用MSCs代替脾脏基质细胞再次重复以上实验,结果证实,在MSCs和活化型抗CD69抗体的双重刺激下,CD4~+CD69~+ T细胞能够分泌TGF-β1。四:初步结论:CD4~+CD69~+ T细胞在正常机体内的存在有利于维持稳态,而在肿瘤条件下这群细胞导致稳态失衡,辅助负向调控,促进肿瘤发展。综上所述,在抑制性免疫微环境和活化型抗CD69抗体的双重作用下,CD4~+CD69~+ T细胞亚群能够产生抑制性细胞因子TGF-β1;而且CD69作为辅助信号在其中发挥重要作用。结果提示,肿瘤发生条件下该细胞亚群数量和功能的变化可能是肿瘤诱导免疫逃逸的新机制,此外,其与肿瘤诱导的抑制性细胞亚群之间精密而高效的调控作用值得进一步深入研究,可望为打破免疫耐受、提高肿瘤免疫治疗的效果提出新的思路。