在各种自然灾害中,旱灾居于首位。在世界范围内,干旱缺水对农业和社会造成的损失相当于其他自然灾害之和。柑桔是世界上产量最大的水果,干旱是柑桔增产的主要限制因子之一。利用分子生物学方法研究柑桔在水分胁迫条件下的应答机制,进而研究其抗旱机理,对于全面认识抗旱性的遗传基础,培育抗旱新品种,研发抗旱栽培技术,具有重要意义。本研究以柑桔椪柑(Citrus.reticulata)为实验材料,构建干旱胁迫诱导表达基因的抑制差减杂交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)cDNA文库,通过对文库的筛选、克隆测序和功能分析,了解柑桔干旱应答机制,为发掘和利用抗旱相关基因奠定基础。用盆栽兴春椪柑自然干旱胁迫作为处理组(Tester),正常浇水作为对照组(Driver),用本实验室改进的苯酚/氯仿/SDS法分别提取上述两种材料的总RNA,分离纯化,获得高质量mRNA各约4μg。采用SSH试剂盒法进行抑制差减杂交,首先将上述两种材料mRNA进行反转录成双链cDNA,然后进行Rsal酶切,之后将Tester酶切产物分成2份:1份与Adoptor1连接,另1份与Adoptor2R连接,最后进行抑制差减杂交;将抑制差减杂交第二次PCR的产物纯化后连接至pTZ57R/T载体中,转化到DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选、培养,获得具有438个重组克隆的SSH文库。将克隆进行菌液PCR检测,得到阳性克隆386个。随机送样测序85个,获得质量较好EST序列78条,其中不重复EST 62条,序列同源性比较结果为90%以上的EST可以在GenBank里找到同源性较高的cDNA,其中80%以上的cDNA源于植物在病原菌诱导、干旱、水分、热击、冷害、盐害等生物或非生物胁迫下特异表达的cDNA文库。在可以找到同源性的EST中,有的在好几个文库中出现,这说明植物所受的各种逆境胁迫都直接或间接影响植物体的水分代谢,各种抗逆反应可能存在某些共同的机制。功能比较分析结果发现有已知功能的EST 51条,根据这些EST所代表的基因的功能可分为8类:代谢、转录、防御、光合作用、蛋白合成、信号传导、能量、未知功能。其中有28个基因与干旱胁迫关系密切,对它们进行了分析讨论。柑桔的干旱胁迫应答过程涉及信号转导、基因的表达调控、物质的合成、防御反应、、活性氧清除和保护光合系统等多种途径。获得与抗干旱胁迫密切相关的钙依赖蛋白激酶、转录因子,脱水素DHN6,、超氧化物歧化酶、NADP—苹果酸酶、热击蛋白、肌醇-1-磷酸合成酶等重要基因的EST。这些EST基本上反映了干旱胁迫下柑桔基因的表达谱。