暗色真菌病（Dark fungal disease,DFD）是由多种暗色真菌引起的慢性肉芽肿性疾病。包括暗色真菌感染皮肤及皮下组织引起的的着色芽生菌病和感染深部、内脏等组织或系统性感染引起的暗色丝孢霉病。其致病真菌隶属于真菌界（Fungi）,双核菌亚界（Dikarya）,囊菌门（Ascomycota）,盘菌亚门（Pezizomycotina）,散囊菌纲/欧洲真菌（Eurotiomycetes）,刺盾炱亚纲（Chaetothyriomycetidae）,刺盾炱目（Chaetothyriales毛壳目）,Chaetothyriales（order）,主要包括着色霉属（Fonsecaea spp.）、枝孢瓶霉属（Cladophialophora spp.）、瓶霉属（Phialophora spp.）、喙枝孢属（Rhinocladiella spp.）和外瓶霉属（Exophiala spp.）。着色霉属Fonsecaea spp.是着色芽生菌病中最常见的致病菌属,包括Fonsecaea pedrosoi,F.monophora,F.nubica和F.pugnacius。1911年Pedroso在巴西首次报道了Fonsecaea pedrosoi感染的病例,之后Fonsecaea spp.引起的感染病例越来越多,裴式着色霉（Fonsecaea pedrosoi）的分类学名称先后经历了Carrionia pedrosoi,Gomphinaria pedrosoi,Trichosporum pedrosianum,Phialophora pedrosoi,Rhinocladiella pedrosoi,Trichosporum pedrosoi,Hormodendrum pedrosoi,Acrotheca pedrosoi,Hormodendroides pedrosoi。主要分布在热带和亚热带气候地区,广泛存在于枯草、腐木和土壤之中,好发于与此环境相关的农民、伐木、园林、建筑工人、赤脚、手工劳作者等免疫力正常的人。往往因皮肤外伤引起致病菌种入侵而感染。该致病真菌呈全球性分布,在南纬30°和北纬30°之间的热带和亚热带沿海地区多见。我国尤家骏教授于1951年于山东发现首例Fonsecaea pedrosoi感染病例,其后全国各地均有报道。Fonsecaea spp.感染导致的暗色真菌病（Dark fungal disease,DFD）常因起始病症轻、临床表现不典型以及皮损多样而起初未得到患者与临床医生的足够重视。多因皮肤出现外伤而使致病菌种侵入患处后发病,还可以通过自身传播或血行播散感染。目前DFD尚无统一规范的治疗“金标准”,主要依靠口服药物与联合手术治疗。随访,患者复发率较高,包括治愈后停用或仍维持用药的患者也会出现。有患者病程持续数年不愈,有报道持续30-40年之久。DFD病程进展发展缓慢,治愈率低,复发率高,给患者和社会造成严重的负担。因此,研究Fonsecaea spp.感染导致的暗色真菌病的临床感染特征、相关易感因素、体外药敏特征、可能的耐药机制、Fonsecaea spp.种群的遗传起源、分布的时空趋势及可能的传播途径、遗传进化、多样性特征等有重要的临床意义与价值。第一部分:致病性Fonsecaea spp.感染的全球报道病例的系统回顾性分析目的:研究致病性着色霉Fonsecaea spp.患者的流行病学、临床特征,潜在的易感因素,为Fonsecaea spp.导致的暗色真菌病（DFD）的临床治疗提供理论依据。方法:通过检索式收集不同语言报道的DFD病例,连续变量（年龄和时间等）以平均值±标准偏差表示;分类变量（包括性别等）以计数和百分数表示,采用方差不齐的非配对两样本T检验分析、Fisher确切概率法,比较两组之间的研究变量。结果:研究发现,2000-2021年间全球传播的四种致病菌（Fonsecaea pedrosoi,F.monophora,F.nubica,F.pugnacius）的感染病例逐年增加。Fonsecaea pedrosoi,F.monophora,F.nubica导致的感染病例报道占比最多。暗色真菌Fonsecaea spp.-DFD病例高发于我国华南、华中、华东、西南、东北等。感染患者平均年龄为54.07±12.57,患者男/女性别比约为3:1。Fonsecaea spp.着色霉引起的皮肤感染多发生于暴露且易受伤的上下肢。男性患者:感染部位的发生频率由高到底的是下肢（大腿,小腿）＞上肢（前臂、上臂）＞足部＞手部＞脚踝＞脸部＞臀部＞脑部＞耳部＞眼部;女性患者:下肢＞上肢＞手部＞脸部＞脚踝＞足部＞脑部＞眼部＞臀部。女性患者明确无外伤史比例多于有创伤史。针对Fonsecaea spp.种水平的鉴定,目前ITS测序应用比较广泛。结论:近20年来,Fonsecaea spp.着色霉（四种致病菌株）感染的病例与分离的致病菌株呈逐渐上升的趋势。我国已成为Fonsecaea spp.着色霉病最多的国家之一,尤其高发于我国华南、华东、东沿海区域以及长江与黄河中下游流域地区。Fonsecaea spp.着色霉的临床表现多样。Fonsecaea spp.着色霉的精确诊断是提高治疗有效率的关键。针对Fonsecaea spp.种水平的分子鉴定,目前基于ITS测序的应用比较广泛。第二部分:分离自国内的Fonsecaea spp.菌种体外抗真菌药物敏感性研究目的:通过体外药敏试验研究分离自我国的着色霉Fonsecaea spp.菌株对现有抗真菌药物敏感性特征,为我国临床精准抗真菌治疗提供科学依据。方法:采用美国临床实验室标准化委员会推荐的丝状菌标准的肉汤微量稀释法（CLSI M38-A2法）,对着色霉Fonsecaea spp.分离株进行10种临床抗真菌药物的体外敏感性试验,总结分离自我国的着色芽生菌Fonsecaea spp.临床菌株的体外药敏特征[3]。结果:分离自我国的Fonsecaea spp.着色霉对泊沙康唑（Posaconazole,MIC50=0.25ug/ml,MIC90=0.5ug/ml）,艾沙康唑（Esacconazole,MIC50=0.25ug/ml,MIC90=0.5ug/ml）,伏立康唑（Voriconazole,MIC50=0.125ug/ml,MIC90=0.25ug/ml）等唑类的抗真菌活性最高,而两性霉素B（Amphotericin B,MIC50=4ug/ml;MIC90=8 ug/ml）、氟康唑（Fluconazole,MIC50=8ug/ml,MIC90＞8ug/ml）、棘白菌素类（Echinocandins,MEC50=8ug/ml,MEC90＞8ug/ml）对Fonsecaea spp.着色霉的抗菌活性较低。Fonsecaea monophora着色霉（n=36）的体外药敏实验中,泊沙康唑（0.109±0.084ug/ml）＞特比萘芬（0.193±0.171ug/ml）＞伏立康唑（0.319±0.313 ug/ml）＞伊曲康唑（0.550±0.333 ug/ml）＞卡泊芬净（3.400±1.400ug/ml）＞5-氟胞嘧啶（7.111±2.963 ug/ml）＞两性霉素B（11.947±9.296 ug/ml）＞氟康唑（14.091±10.463ug/ml）。Fonsecaea pedrosoi着色霉（n=34）的体外药敏实验中,泊沙康唑（0.25±0.000ug/ml）＞特比萘芬（0.435±0.227ug/ml）＞伏立康唑（0.792±0.346 ug/ml）＞伊曲康唑（2.063±1.283 ug/ml）＞卡泊芬净（3.500±1.920ug/ml）＞两性霉素B（4.50±1.694 ug/ml）＞氟康唑（14.091±10.463ug/ml）＞5-氟胞嘧啶（17.333±8.250 ug/ml）。在Fonsecaea nubica着色霉（n=13）的体外药敏实验中,泊沙康唑（0.014±0.000ug/ml）＞特比萘芬（0.229±0.142 ug/ml）＞伏立康唑（0.625±0.333ug/ml）＞伊曲康唑（0.844±0.443 ug/ml）＞卡泊芬净（3.500±2.250ug/ml）＞5-氟胞嘧啶（3.333±9.111 ug/ml）＞两性霉素B（6.000±2.278 ug/ml）＞氟康唑（14.091±10.463ug/ml）结论:全球流行的Fonsecaea spp.着色霉的三个常见的致病菌种对所检测的10种抗真菌药物的敏感性以及临床治疗有效率结果一致且由高到低依次为:Fonsecaea monophora,Fonsecaea nubica,Fonsecaea pedrosoi。针对Fonsecaea spp.感染所致的暗色真菌病的抗真菌治疗,宜优先选择二代唑类药物（泊沙康唑（Posaconazole）,艾沙康唑（Esacconazole）,伏立康唑（Voriconazole）等）,其次为特比萘芬（Terbinafine）、伊曲康唑（Itraconazole）、两性霉素B（Amphotericin B）、卡泊芬净（Caspofungin）。多种抗真菌药物（特比萘芬、伊曲康唑、两性霉素B、氟康唑）对Fonsecaea spp.着色霉的抗菌活性有降低趋势,但目前相关的联合用药的研究仍然不系统、全面,相关研究进展缓慢。第三部分着色霉Fonsecaea spp.菌株的分子鉴定及系统发育分析研究目的:通过多基因片段测序及序列分析对着色霉Fonsecaea spp.菌株进行分子鉴定及遗传多样性分析,明确着色霉Fonsecaea spp.的种群构成及种间遗传变异特征。同时拟从我国大陆自然环境中检测、分离、培养出Fonsecaea spp.着色霉菌株,丰富自然环境来源理论假说。方法:收集分离自我国的着色霉Fonsecaea spp.菌株31株,进行培养、鉴定及种水平的基因分型,以揭示其群体遗传学特征;采用核酸扩增技术分别对ITS,BT2,Cdc42,Lac,PKS1,ESP,FOMO,FOUN,FOPE,FOPU等基因片段进行扩增测序,与NCBI数据库进行BLAST比对后初步鉴定至菌种水平[16];并评估这10个单基因片段序列对鉴定着色霉Fonsecaea spp.的有效性[16];分析收集的Fonsecaea spp.菌株遗传数据分析、系统发育和核糖体内部转录间隔（ITS）序列使用MEGA v.11,序列使用Clustal W选项进行比对,使用Kimura 2参数模型加Gamma分布校正（K2+G:0.96）,邻接法（Neighbor Joining,NJ）与最大似然法（Maximum Likelihood Method,ML）,500次Bootstrap值。所有的时间系统发育树都是使用Rel Time-ML方法建立的。结果:收集的菌种中裴式着色霉F.pedrosoi 9株（29.03%）,F.monophora着色霉18株（58.06%）,F.nubica着色霉6株（19.35%）。ITS序列将Fonsecaea spp.着色霉鉴定到种水平,41.9%为Fonsecaea pedrosi,35.4%为Fonsecaea monophora,16.1%为Fonsecaea monophora/Fonsecaea pedros,3.2%为Fonsecaea pedrosi/Fonsecaea nubica,BT2将Fonsecaea spp.着色霉全部识别为Fonsecaea monophora。Cdc42将Fonsecaea spp.着色霉鉴定为74.2%为Fonsecaea monophora与25.8%为Fonsecaea nubica。Lac将Fonsecaea spp.着色霉鉴定为93.5%为Fonsecaea monophora与6.5%为Fonsecaea nubica。PKS1将Fonsecaea spp.着色霉鉴定为100%为Fonsecaea pedrosi。ESP将Fonsecaea spp.着色霉鉴定为58.0%为Fonsecaea monophora,6.5%为Fonsecaea nubica,16.1%Cladophialophora immunda,19.4%非特异性扩增。FOMO将Fonsecaea spp.着色霉鉴定为83.8%为Fonsecaea monophora与12.9%为Fonsecaea nubica,3.2%为Fonsecaea pedrosi/Fonsecaea nubica。FOUN将64.5%为Fonsecaea spp.着色霉鉴定为Fonsecaea monophora与35.5%为Fonsecaea nubica。FOPU将Fonsecaea spp.着色霉鉴定为29.0%为Fonsecaea pedrosi,6.5%Fonsecaea monophora,6.5%为Fonsecaea nubica,41.9%为Fonsecaea monophora/Fonsecaea pedrosi,16.1%为非特异性扩增。Fonsecaea spp.菌种分化时间顺序可能为Fonsecaea brasiliensis（约38.27 Ma）,F.multimorphosa（约21.30 Ma）,F.minima（约20.01 Ma）,F.erecta（约19.11 Ma）,F.pedrosoi（约17.41 Ma）,F.pugnacius（约8.23Ma）,F.nubica（约1.64Ma）,F.monophora（约0.08 Ma）。Fonsecaea pedrosoi,F.monophora,F.nubica三个全球流行的Fonsecaea spp.致病菌株占比最多,并且每个菌株与其他国家的菌种亲缘关系比较近。Fonsecaea spp.临床分离株与环境非致病菌株有密切的亲缘关系。在真菌分类学与遗传进化中新增进化/分歧时间这一维度,可更清晰展示真菌种群演进化。结论:ITS测序及序列分析仍然是Fonsecaea spp.分子鉴定的主要参考标准。Fonsecaea spp.菌种进化分化顺序可能为Fonsecaea brasiliensis,Fonsecaea multimorphosa,Fonsecaea minima,Fonsecaea erecta,Fonsecaea pedrosoi,Fonsecaea pugnacius,Fonsecaea nubica,Fonsecaea monophora。Fonsecaea spp.致病菌种可能来源于环境菌株。第四部分:Fonsecaea spp菌种全球传播方式与传播模式相关假说目的:更加全面的分析Fonsecaea spp.着色霉菌株的种群结构、遗传进化、传播路径,传播途径,以揭示其种群扩张等群体遗传学特征。方法:Dna SP v.6（http://www.ub.edu/dnasp/）被用来确定DNA多态性。所有单倍型网络模型都是用Pop ART 1.7（http://popart.otago.ac.nz/index.shtml）构建的。分类变量的比较采用卡方检验。如果P值≤0.05,则认为组间的差异具有统计学意义。分歧时间以百万年前（Ma）为单位。结果:Fonsecaea pedrosoi,F.monophora,F.nubica三个全球流行的致病菌株占比最多,并且每个菌株与其他国家亲缘关系比较近的菌种。在Fonsecaea pedrosoi着色霉中,共育9条单倍体产生。Fonsecaea pedrosoi着色霉菌群型（Hap1）多见于巴西,哥伦比亚,波多黎各,委内瑞拉,阿根廷,乌拉圭,墨西哥,古巴,莫桑比克,刚果,利比亚,荷兰,美国,哥斯达黎加,澳大利亚,越南,泰国,中国,日本群亚型。其中,分离自巴西的Fonsecaea pedrosoi的单倍体多样性最丰富,最多样。在Fonsecaea monophora着色霉种群中,产生19个Fonsecaea monophora着色霉种群亚群单倍体型。Fonsecaea monophora着色霉种群亚群（Hap 1）流行于刚果,美国,几内亚,荷兰,墨西哥,古巴,哥斯达黎加,巴西,马来西亚,印度,泰国,中国（台湾,南京,上海,广州）,韩国菌群亚型。在Fonsecaea nubica着色霉种群中,共产生出15个Fonsecaea nubica着色霉种群亚群单倍体亚型。其中以分离自非洲马达加斯加地区Fonsecaea nubica着色霉种群的单倍体多样性最丰富,最多样。结论:本研究对全球Fonsecaea spp.的病例与可收集到的相关菌株进行了系统分析。发现全球流行的Fonsecaea spp.可能来源于海洋,并且有三个主要的传播起源中心。Fonsecaea pedrosoi变异起源地为（太平洋的北部,与大西洋的北部靠近靠近巴西、哥斯达黎加、哥伦比亚、尼加拉瓜、委内瑞拉、墨西哥等加勒比海、北太平洋,北大西洋台风频发的海域）;Fonsecaea monophora变异起源地为靠近中国南海的区域;F.nubica变异起源地靠近非洲马达加斯加附近;Fonsecaea pugnacius起源于巴西附近的大西洋。传播方式与模式为夏秋季频繁发生的海洋台风驱动。我们提出的假设是,环境中的非致病性环境菌株（Fonsecaea brasiliensis,F.multimorphosa,F.minima和F.erecta）进化成致病性菌株（Fonsecaea pedrosoi,F.pugnacius,F.nubica和F.monophora）,并通过全球热带气旋和洋流途径传播到全球。F.multimorphosa对人类具有潜在的传染性,值得警惕及后续相关研究进一步监测。本研究的结果加深了对Fonsecaea spp.传播方式等群体遗传学特征的认识,将促进Fonsecaea感染的预防、治疗和治疗研究,并为其他致病真菌和环境真菌领域的研究提供科学参考。