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早产是最常见的产科并发症之一,也是新生儿致死和致畸的首要原因。然而,早产的发生率近几十年来并未得到有效控制,除去外界因素外,根本原因在于人类分娩启动机制尚未完全阐明。因此,明确分娩启动的机制以降低早产发生率刻不容缓。我们课题组前期的工作发现甾体激素受体共激活因子（Steroid receptor coactivators,SRC）缺陷小鼠胎肺发育迟缓且出现过期产,提示分娩启动异常可能与胎肺的成熟及胎源性因子的分泌障碍有关。为此,我们对交配后18.5天（18.5dpc）的SRC缺陷小鼠和野生型（Wild type,WT）小鼠的胎肺进行RNA-seq分析并验证,发现精氨酸酶（Arginase 1,Arg1）和精氨酸代琥珀酸合成酶（Argininosuccinate synthetase 1,Ass1）的转录水平在SRC1/2双基因纯合敲除（dKO）小鼠胎肺中显著降低。Arg1和Ass1为尿素循环的代谢酶,与精氨酸的合成和代谢有关。因此,我们进一步检测了胎肺中的氨基酸等小分子代谢物的水平,发现精氨酸含量在dKO组中显著升高,而精氨酸的代谢产物鸟氨酸的水平呈相反的变化趋势,与Arg1表达水平的变化一致。由于Arg1是肺发育通路中的一个关键基因,影响细胞的增殖和凋亡,因此我们提出科学假说:Arg1通过影响胎肺发育和相关小分子代谢物的合成来协调胎儿发育和分娩启动。本课题围绕Arg1对胎肺的生长发育和分娩启动的影响进行探究。我们对Arg1和Ass1在正常妊娠中晚期胎肺中的表达和定位进行检测,而后使用胎盘注射的方法干扰小鼠胎肺中Arg1的表达,观察分娩启动时间以及胎肺的生长发育情况。通过以上实验,明确Arg1在协调胎肺发育和分娩启动中的作用,为探究早产的机制和预防早产提供新的靶点。主要实验结果如下:一、SRC1/2 dKO小鼠胎肺组织中的Arg1和Ass1表达水平显著下降1.RNA-seq分析表明18.5 dpc的dKO小鼠胎肺中的Arg1和Ass1的转录水平较WT小鼠显著降低;2.进一步通过定量PCR、Western blotting以及免疫组化实验表明dKO小鼠18.5 dpc的胎肺中Arg1和Ass1的mRNA及蛋白的表达较WT组均下调。二、野生型小鼠胎肺组织中Arg1和Ass1的表达水平在妊娠后期显著升高1.实时定量PCR和Western blotting检测结果表明Arg1和Ass1在野生型小鼠妊娠中后期胎肺中的mRNA和蛋白的表达显著上调,且在19.5 dpc达到顶峰;2.免疫组化实验结果也表明在野生型小鼠妊娠第15.5、17.5和19.5天的胎肺中均有Arg1和Ass1的表达,且在15.5 dpc的表达最低,19.5 dpc的表达最高。3.多重免疫荧光实验结果表明Arg1在Ⅱ型肺泡上皮细胞上有表达,而Ass1主要在Ⅰ型肺泡上皮细胞中表达。三、dKO小鼠孕18.5天的胎肺中精氨酸的含量较野生型小鼠显著升高,而鸟氨酸的含量显著降低1.采用LCMS-MS结合MRM技术对18.5 dpc的WT及dKO小鼠胎肺组织行广谱靶向代谢组学检测,共检测了200种小分子代谢物。KEGG通路富集分析结果表明,精氨酸生物合成通路以及精氨酸和脯氨酸代谢通路均显著富集;2.广谱靶向代谢组学的单个代谢物含量的结果表明,Arg1的反应底物精氨酸的浓度在dKO组中较WT组显著上调,代谢产物鸟氨酸的浓度则显著下调。Ass1催化的代谢反应的底物瓜氨酸含量无显著差异,另一底物天冬氨酸和反应产物精氨酸代琥珀酸因浓度太低未检测到。四、敲低小鼠胎肺中Arg1的表达可使孕鼠出现分娩延迟1.将干扰Arg1表达的AAV（AAV-Arg1）或空载AAV（AAV-2/9）注射至13 dpc的WT小鼠胎盘中。结果显示,2种腺相关病毒（Adeno-associated virus,AAV）均成功感染胎肺,AAV-Arg1可显著降低胎肺中Arg1的蛋白表达,但胎肝、胎盘和子宫肌中Arg1的表达却无明显变化。2.相较于空载病毒组,注射AAV-Arg1的小鼠18.5 dpc子宫肌中NF-κB活化减少,收缩相关蛋白表达下调,孕鼠出现分娩延迟。五、干扰WT小鼠胎肺中Arg1的表达可促进胎肺细胞凋亡1.胎盘注射AAV后,检测临产胎肺细胞的增殖和凋亡情况。结果显示,Ki67与Caspase3前体的表达在Arg1干扰组和对照组相比均无显著差异;而Caspase3剪切体的表达在干扰组显著上调,提示Arg1的敲减不影响胎肺细胞的增殖,但可以促进胎肺细胞凋亡;2.TUNEL法和免疫荧光法的检测结果进一步验证,AAV-Arg1处理后临产胎肺组织中细胞凋亡较AAV-2/9处理显著增加,而细胞增殖无明显变化。结论SRC1/2双基因敲除导致Arg1和Ass1在胎肺中的表达特异性降低。在正常妊娠过程中,两者在胎肺中的表达随着胎鼠的生长发育而逐渐升高,并在临产时达到顶峰,Arg1和Ass1分别在Ⅱ型和Ⅰ型肺泡上皮细胞中表达。这两个关键酶与精氨酸以及瓜氨酸的合成与代谢密切相关,胎肺中精氨酸和瓜氨酸的水平变化与Arg1的表达变化一致,干扰胎肺中Arg1的表达使得胎肺细胞凋亡增多,提示我们Arg1可能通过改变胎肺中的氨基酸代谢促进细胞凋亡,影响胎肺的发育。胎肺中Arg1的敲低还可显著抑制子宫肌中NF-κB的活化,并下调收缩相关蛋白的表达,小鼠的分娩显著延迟。本课题的研究结果表明Arg1可能通过氨基酸代谢在协调胎肺发育和分娩启动方面发挥双重作用,胎源性因子可成为治疗胎儿器官不成熟和预防早产的潜在靶点。