研究背景和目的根据最新癌症数据显示,原发性肝癌（primary liver cancer,PLC）是全球第六大最常见肿瘤疾病,第二大癌症死亡原因。在我国则是第五大最常见肿瘤疾病,第二大癌症死亡原因。肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）占原发性肝癌75%-85%。其恶性程度高,预后差,即使是接受根治性切除的患者,术后5年复发率可高达70%。肿瘤转移是导致90%以上癌症相关死亡率的原因,侵袭是肿瘤进展的关键步骤和转移的驱动力。关于肝细胞癌的侵袭的研究多在二维细胞里进行,大量报道已经阐明了细胞在二维玻璃和塑料的基底上侵袭的详细分子和生物物理机制,而更加接近病理情况下的复杂的三维环境中肿瘤如何侵袭我们所知甚少。与二维的细胞侵袭相比,三维细胞侵袭尤其具有挑战性。在三维空间中,细胞必须对所遇到的多种障碍作出反应,包括坚硬且狭窄的细胞外基质孔、侧向挤压和限制和物理上不可穿透的障碍。三维侵袭包括间充质细胞侵袭模式、阿米巴细胞侵袭模式、叶状伪足侵袭模式或集体细胞侵袭模式。根据细胞类型和环境条件,细胞可以灵活地采用几乎任何组合的迁移参数在多种侵袭模式之间转换。目前关于肝细胞癌在三维环境下是否发生侵袭、采取何种侵袭模式,三维侵袭是否与上皮间质转换（epithelial–mesenchymal transition,EMT）相关,尚未有研究报道。因此,本研究旨在建立肝癌类器官,并利用肝细胞癌类器官探索哪些关键基因与细胞外基质影响侵袭的发生,以及三维侵袭与EMT的关系;并通过建立索拉菲尼耐药类器官,验证耐药表型是否与侵袭、EMT相关。为后续针对肝细胞癌侵袭进行相应的药物研发提供理论依据。研究方法本研究纳入术前诊断为肝癌并接受手术切除患者的肿瘤组织构建类器官,并收集患者一般临床信息分析影响类器官构建的临床特征。利用免疫组化确认其跟肿瘤组织的一致性。构建类器官来源异种移植（organoid derived xenograft,ODX）模型探索哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）抑制剂复方在体内体外的抗肿瘤效果。通过检测类器官中关键干性基因的表达,明确与侵袭有关的关键基因,构建稳转株,通过观察侵袭是否发生确定关键基因对侵袭的影响。此外,还构建了索拉菲尼耐药类器官,探索耐药表型与侵袭是否相关。研究结果1、本研究共收取新鲜肿瘤组织样本160例,其中肝细胞癌患者131例,建成肝细胞癌类器官38例,构建成功率为29.0%。2、肝细胞癌类器官构建成功与否与肿瘤直径大小（P＜0.001）、肿瘤微血管侵袭（P＜0.005）、TNM分期（P＜0.005）、BCLC分期（P＜0.005）等相关临床特征有关。3、经免疫组化证实,原发性肝癌类器官在长期培养条件下也能较好的再现和保留原肿瘤组织和亚型的组织学特征和标志物表达情况4、即使经过体内移植,原发性肝癌培养的肿瘤类器官仍能很好地保留对应肿瘤的组织学结构和形态特征5、不同肝癌亚型类器官对mTOR抑制剂复方反应不一,其中,肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinomas,ICC）和混合型肝癌（combined hepatocellular and intrahepatic cholangiocarcinoma,c HCC-ICC）对其效果最好。6、肝细胞癌侵袭发生是关键基因与细胞外基质共同作用的结果,高表达上皮细胞粘附分子（Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM）和CK-19的类器官培养在I型胶原中可发生侵袭,分别敲低EpCAM和CK-19后,可有效阻止侵袭发生。7、索拉菲尼耐药类器官在获得耐药表型的过程中总体表现为抑制EMT,干性增强,稳定耐药表型后,培养在脱离索拉菲尼的环境中,可发生侵袭。研究结论本研究通过构建类器官模型,发现mTOR抑制剂复方对肝内胆管癌和混合型肝癌对其效果最好,并发现CK-19和I型胶原共同促进肝细胞癌发生侵袭。此外,通过构建索拉菲尼耐药类器官,发现获得性耐药过程中总体表现为抑制EMT,干性增强,侵袭潜能增强。撤离索拉菲尼后,耐药类器官表现出侵袭行为。