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【研究背景】膀胱癌是我国男性最常见的泌尿生殖系肿瘤,病理分类大多为尿路上皮癌。患者的病理特征及临床预后呈现非常大的差异性。其中肌层浸润型预后最差,行膀胱癌根治术手术时间长,围手术期风险高,术后生活质量以及疾病转归较差,其转移及死亡率均较高。而非肌层浸润型术后需定期进行经尿道膀胱镜的复查,具有高复发率、部分进展为肌层浸润型的特点。故准确的分子靶向标志物,对于膀胱癌患者的早期诊断,危险程度分级,治疗手段的选择,和晚期膀胱癌患者的精准靶向治疗及预后评估尤为重要。NEK2经研究通过作用于细胞周期的中心体形成来影响肿瘤细胞的有丝分裂和染色体稳定性来影响肿瘤细胞的进展。多项研究表明NEK2对于肿瘤细胞具有促癌的作用,促进肿瘤的侵袭及进展,且NEK2与肿瘤细胞染色体不稳定性、肿瘤分化发展和化疗药物耐药性之间都有直接关系,但在人类膀胱癌中的影响作用及机制目前尚未研究。【研究目的】研究NEK2在膀胱尿路上皮癌组织基因中的表达,探究NEK2表达情况与膀胱癌根治术术后患者的病理特征、临床预后、复发及生存率的关系,研究NEK2在细胞功能水平上对各膀胱尿路上皮癌细胞系的作用,探索NEK2在膀胱癌的作用机制,最终寻找可应用于膀胱癌早期诊断和治疗措施选择上的新靶标。【研究方法】1.对膀胱癌病患术后肿瘤标本进行高通量测序,研究所得数据,结合公共数据库及查询相关文献,研究NEK2基因在膀胱癌癌灶组织和肿瘤基底组织中的表达情况。2.通过Real-time PCR技术检测研究NEK2在膀胱尿路上皮癌中RNA的表达状况。3.在病理免疫组化层面检测NEK2在膀胱癌组织及转移性淋巴结中的表达情况,使用膀胱癌患者术后标本进行病理组织芯片制作、免疫组化染色及评分和分组以及对病患电话随访术后生存、复发及治疗情况并做好相关记录,研究NEK2表达水平与膀胱癌疾病生存及预后之间的关联。4.通过Real-time PCR技术探究NEK2在膀胱癌各细胞系中表达情况。5.构建NEK2敲减和多表达质粒载体,用慢病毒包装后对筛选后的膀胱癌细胞系进行转染,构建膀胱癌敲减和过表达NEK2的稳转细胞株,利用Real-time PCR技术和western blot技术验证转染效率。6.展开CCK8细胞增殖实验,细胞划痕实验,小室侵袭及迁移实验在细胞功能水平研究NEK2敲减和过表达对膀胱癌细胞功能的影响。7.通过对建立的稳转细胞株提取RNA进行单细胞转录组测序及生物信息学分析,来探索NEK2作用于膀胱癌的可能调控机制。【研究结果】1.经过转录测序,与患者本人正常膀胱尿路上皮组织进行对比,计算膀胱癌组织中NEK2基因的RPKM值,显示NEK2基因在膀胱癌组织和肿瘤基底组织中的表达量显著上升（P值小于0.01）。2.Real-time PCR实验验证表明,NEK2在膀胱癌组织中RNA的表达量显著上升（P值小于0.01）。3.免疫组化染色实验结果证实NEK2在膀胱癌肿瘤组织和转移性淋巴结中表达量明显上升。成功制作患者病理组织芯片,110例行膀胱癌根治术患者病理组织芯片的免疫组化的结果显示,NEK2表达量与患者病理T2期以上分期数目呈正相关（P值小于0.01）,与发生盆腔淋巴结转移的占比成正相关（P值小于0.01）,与性别、肿瘤个数、肿瘤大小、疾病是否初发复发、肿瘤病理分级并无统计学关联。生存分析显示NEK2高表达量与病患行根治术后OS、PFS数值成负相关（P值小于0.05）。NEK2表达量可作为对于膀胱癌患者疾病分期、生存及预后评估预测的标志物。4.对J82、RT4、T24、5637、UMUC3细胞等常见膀胱癌细胞及SVHUC-1细胞进行RT-PCR检测,发现MIBC细胞系中的（J82、T24）细胞NEK2表达量高于NMIBC细胞系（RT4）及SVHUC-1细胞系。5.成功构建NEK2敲减和过表达的J82、T24细胞株和NEK2过表达的RT4稳转细胞株。6.在细胞功能水平研究中,Transwell小室侵袭和迁移实验结果显示,NEK2敲减明显降低了膀胱癌细胞的侵袭及迁移能力（P值小于0.01）,NEK2过表达提高了膀胱癌细胞的侵袭及迁移能力（P值小于0.01）。细胞划痕实验显示,24小时后NEK2敲减组划痕生长面积弱于对照组（P值小于0.01）,NEK2过表达组划痕生长面积大于对照组（p值小于0.01）。细胞增殖实验表明NEK2未影响到膀胱癌细胞的增殖（P值大于0.05）。NEK2表达量与膀胱癌细胞侵袭和迁移功能呈正相关。7.细胞稳转株转录组检测结果提示NEK2表达量与p53表达量及p53相关信号通路相关,计算相关RPKM值,NEK2表达水平与p53基因表达量成负相关（P值小于0.05）。【研究结论】NEK2在膀胱癌尿路上皮肿瘤组织中明显高表达,且其表达含量可以用来评估预测患者在疾病分期中T2期以上的概率和盆腔淋巴结转移概率,NEK2表达量上调患者生存及预后较NEK2表达量低患者明显较差。在膀胱癌细胞系中,敲减NEK2可明显减弱膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力。综上所述,NEK2可作为预测膀胱癌疾病危险评估、分期、预后和治疗手法选择上的靶向分子标志物。在膀胱癌细胞系中,敲减NEK2可能导致p53基因表达量上调,p53信号通路可能是NEK2作用于膀胱癌细胞潜在的机制。