【摘 要】
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在已知的人类致病遗传变异中,约有一半是由单核苷酸变异(Single Nucleotide Variant,SNV)引起的。因此开发出高效的点突变纠正工具是人类遗传疾病研究和治疗的重要目标。单碱基编辑技术通过在CRISPR-Cas9系统中加入脱氨酶从而在细胞基因组中特定位点进行单核苷酸突变,该技术只会造成DNA单链断裂,具有更高的安全性。然而碱基编辑技术也存在一定的局限性:首先,编辑效率较低限制了临
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在已知的人类致病遗传变异中,约有一半是由单核苷酸变异(Single Nucleotide Variant,SNV)引起的。因此开发出高效的点突变纠正工具是人类遗传疾病研究和治疗的重要目标。单碱基编辑技术通过在CRISPR-Cas9系统中加入脱氨酶从而在细胞基因组中特定位点进行单核苷酸突变,该技术只会造成DNA单链断裂,具有更高的安全性。然而碱基编辑技术也存在一定的局限性:首先,编辑效率较低限制了临床应用潜力;其次,主流的碱基编辑器受到序列识别位点PAM序列的限制,只有当靶位点下游13-17bp范围内存在NGG PAM序列时才能进行编辑,限制了可编辑位点的范围;另外,碱基编辑器存在大约5 bp的编辑活性窗口,有可能在编辑位点周围形成旁观者编辑(Bystander Editing),因此仍需要进一步优化改造来实现编辑范围更广,编辑位点更精准的基因编辑。为了扩大基因组的编辑范围,实现精准编辑,我们在近乎PAM-less的腺嘌呤碱基编辑器(ABEmax-SpRY)的基础上通过替换编辑器上主要表达元件改造了新的编辑器,改造的主要方式包括:(1)引入Cas9-SpRY蛋白变体以降低对PAM序列的限制。(2)对sgRNA的scaffold部分优化以提升转录效率。(3)优化升级腺嘌呤脱氨酶:使用截短且脱氨速率提升的TadA-8e腺嘌呤脱氨酶。(4)将连接腺嘌呤脱氨酶与SpRY蛋白的XTEN连接肽替换为P(AP)3刚性连接肽或直接删除连接肽以限制脱氨范围。(5)替换NLS核定位信号为FNLS。通过以上方式我们改造了几种近乎不受PAM序列限制且编辑效率提高的腺嘌呤碱基编辑器。接下来我们通过构建sgRNA与靶序列一一对应文库并建立高通量编辑效率报告系统以评估各版本腺嘌呤碱基编辑器的编辑效率及编辑活性窗口的分布,从而选出较优版本的编辑器。本研究改造了可编辑范围扩大且编辑效率提升的腺嘌呤碱基编辑器,在基础研究领域,可以编辑过去不可及的许多单核苷酸变异位点,为研究人类单核苷酸变异与疾病发生发展的关系提供了有力的单碱基编辑工具,为高通量筛选致病突变位点提供了新的实验方法。腺嘌呤碱基编辑器作为一种具有治疗前景的基因编辑工具,需要进行不断的升级优化,从而更好的应用在临床基因治疗中。
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目的1.以膈肌超声评估:与新斯的明相比,舒更葡糖钠是否可以降低术后肌松残余(PORC)发生率。2.以术后随访和肺超声(LUS)评估:与新斯的明相比,舒更葡糖钠拮抗是否可以降低术后肺部并发症(PPCs)发生率及LUS表现是否更佳。方法纳入2021年3月-2021年12月于北京协和医院行髋或膝关节置换手术的患者121名,ASA分级Ⅰ-Ⅲ级,年龄≥60岁,性别不限,按随机数表随机纳入舒更葡糖钠组(SUG
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