松子源活性肽制备及其抗氧化活性研究

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本论文主要研究了松子蛋白水解肽的制备及其抗氧化功能,并初步探讨了松子蛋白水解肽抗氧化活性与其氨基酸序列及相对分子质量之间的关系。通过索氏抽提法脱脂得到松子粕;再利用碱溶酸沉的提取方法对脱脂松子粕中蛋白质进行提取。采用碱性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶分别对松子蛋白进行酶解,酶解后测定其水解度,结果表明,碱性蛋白酶酶解后的松子蛋白水解度最高,达到5.8%,故选择碱性蛋白酶进行后续试验。通过单因素试验制备了不同水解条件下水解的松子肽,优化碱性蛋白酶酶解条件,结果表明:碱性蛋白酶最优水解条件:酶解pH 9.5;加酶量6000 U/g;底物浓度3%;酶解时间5 h。在此条件下蛋白水解度为11.2%。对松子蛋白水解肽进行体外抗氧化活性研究:以总还原力、DPPH.清除率、O2-·清除率以及.OH清除率为指标,测定松子蛋白水解肽的体外抗氧化能力。结果表明,松子蛋白水解肽具有较强的抗氧化能力,具体表现在其还原能力及清除自由基能力,且其抗氧化能力与其浓度有一定的线性关系,抗氧化能力随浓度的增加而增加。对松子蛋白水解肽进行体内抗氧化实验。首先建立D-半乳糖致衰老小鼠模型,低、中、高剂量组为每天灌胃167mg/kg、333 mg/kg、1000 mg/kg松子蛋白水解肽,同时灌胃维生素C作为阳性对照。结果表明,松子蛋白水解肽剂量组能够显著提高D-半乳糖致衰老小鼠的肝脏、心脏及血清中超氧化物歧化酶活性(p<0.05),显著降低其体内丙二醛含量同时增加其体内谷胱甘肽含量(p<0.05),松子蛋白水解肽剂量组还能有效降低D-半乳糖致衰老小鼠的肝脏中蛋白质羰基含量,与维生素C组实验结果接近。表明松子蛋白水解肽对小鼠有一定的抗氧化、防衰老作用。通过超滤对松子蛋白水解肽进行初步分离,分离得到三个组分,Fra.1(<5 kDa)、Fra.2(5 k~10 kDa)和Fra.3(>10 kDa),以DPPH·清除率为指标测定不同组分活性肽的清除自由基能力。结果显示,清除自由基能力为:Fra.1>Fra.2>Fra.3。且同一组分中,随着活性肽浓度的增大,清除自由基能力增强。选择高活性组分Fra.1进行后续纯化。再利用Sephadex G-25凝胶色谱分离得到两个组分,其中组分F2的DPPH·清除率最高,可达到83%;用高效液相色谱仪对F2进行分子量分布的测定,结果显示相对分子质量在1000Da以下的肽段占总含量的93%以上。通过LC-MS/MS鉴定,鉴定出10条潜在抗氧化活性肽段,分别为:FEDLPEKF、PEDMLNLR、FSNRPRLMY、CFDDELREE、CFDDDLREE、PDDEFRPE、RDECKVCF、MYEREPPEAE、SERPDLEPR、YMEDELRM。
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