氮素是生命元素,是植物生长需要量最大的必需营养元素,但同时也是绝大部分农业土壤中难以满足的元素,作物高产离不开氮肥的施用。提高作物的氮素利用效率不仅是重要的科学问题,而且也是节约资源和保护生态环境的紧迫问题。作物的理想根系构型是提高包括氮素在内的养分吸收的重要前提。植物根系形态的构建受到的因素众多,包括了外界因素（如土壤氮素供应）和内部因素（如植物激素）的影响。水稻是中国种植面积最广的农作物,尽管它生长在水田,但是强烈的根际硝化作用使得水稻根系长期处于铵、低浓度硝酸盐并存的土壤环境。生长素是最早发现的一类重要植物激素,大量的研究表明,硝对于植物根系的调控是通过生长素的合成、降解及其局部分配来完成的。在拟南芥中已经鉴定有四种的色氨酸依赖性吲哚乙酸（indole-3-aceticacid,IAA）生物合成途径,其中吲哚-3-乙腈（indole-3-acetonitrile,IAN）已被确定为吲哚-3-乙醛肟（indole-3-acetaldoxime,IAOx）介导的IAA生物合成中的两个关键中间体之一,而腈水解酶则是IAN向IAA的转化过程中的关键酶。此外,在拟南芥和玉米籽粒中也已经证明了内源腈水解酶和其底物IAN的存在,并且用实验证明了这些物种的腈水解酶都可以水解IAN。本实验室之前的研究发现OsNAR2/OsNRT2双组分系统在水稻根系硝酸盐吸收分配和根系对硝酸盐供应的响应中具有关键功能,其中硝酸盐转运伴侣蛋白OsNAR2.1可能参与控制侧根形成的N03-信号传导途径。然而,其作用机制并不清楚。本研究首先以OsNAR2.1为诱饵做了水稻根系蛋白的Pull Down实验,发现预测的腈水解酶蛋白OsNIT1和OsNIT2是潜在的与OsNAR2.1互作的蛋白。在此基础上,深入鉴定了OsNAR2.1与OsNIT1和OsNIT2的互作关系以及互作位置。利用T-DNA插入和CRISPR/Cas 9系统敲除技术获得OsNIT1、OsNIT2突变体,进而通过杂交获得了 osnit2-2×osnar2.1-1双敲除突变体。在此基础上,通过qPCR分析,基因测序和不同氮素条件培养等确认了材料的可靠性和其生理表型;通过15N示踪、氮素浓度测定和田间表型分析,明确了 OsNIT1和OsNIT2在硝酸盐的吸收与转运方面的功能。此外,通过体外酶活性检测和3H-IAA示踪等实验分析了OsNIT1和OsNIT2与IAA合成分配的关系。所获主要结果如下:1.通过酵母双杂交和免疫共沉淀（Co-IP）实验进一步证实了 OsNAR2.1和OsNIT1、OsNIT2之间的蛋白质互作关系。此外,通过qPCR分析,发现水稻根中OsNAR2.1,OsNIT1和OsNIT2的表达都会受到硝酸盐的诱导且表达趋势一致。原位杂交显示,在硝酸盐培养条件下,OsNAR2.1,OsNIT1和OsNIT2在水稻根中的表达模式几乎相同,它们共定位于根尖。亚细胞定位结果也表明OsNAR2.1,OsNIT1和OsNIT2在细胞水平上有一致的定位。2.通过T-DNA插入、CRISPR/Cas9系统和杂交技术获得了osnit1,osnit2,osnar2.1单突变体和osnit2-2 ×osnar2.1-1双突突变体。利用qPCR分析了供硝条件下OsNIT1和OsNIT2在osnar2.1突变体中的表达,发现它们的表达均下调。硝酸盐供给培养时,OsNIT1、OsNIT2和OsNAR2.1的敲除均导致水稻出现主根变短,侧根密度下降的表型。此外,在供硝条件下,双突突变体osnit2-2×osnar2.1-1的主根根长与单突osnit2-2和单突osnar2.1-1都相似,而双突变体的侧根密度与单突osnit2-2和单突osnar2.1-1相比都减少。3.发现OsNIT1和OsNIT2的敲除不会影响根中OsNAR2.1和硝酸盐转运蛋白基因OsNRT2.1和OsNRT2.3的表达。15N同位素示踪实验结果显示,OsNIT1、OsNIT2的敲除并不会影响硝酸盐瞬时吸收速率,这表明OsNIT1和OsNIT2不会反馈影响OsNAR2.1在氮素吸收中的功能。在扬花期时,生长于正常施氮水平土壤中的osnit1和osnit2突变体的总氮浓度与野生型的总氮浓度无显著差异,但由于突变体的生物量低于野生型,突变体的总氮含量对应下降。在成熟期时,osnit1和osnit2旗叶中的氮浓度均低于野生型。这可能是由于OsNIT1和OsNIT2的敲除影响水稻氮素从倒一叶向籽粒运输的能力。与osnar2.1不同,osnit1和osnit2的根系吸收硝酸盐的速率与野生型相同。4.发现外源施加10 μMIAN会强烈抑制水稻（日本晴）主根的伸长。敲除OsNIT1可以增强水稻根系对于IAN的抵抗能力。用10 pMIAN处理osnit1和野生型时,osnit1的主根长度相比野生型增长约140%,侧根密度相比野生型减少约40%。osnit2也表现出与osnit1相似的表型,但敏感度减弱不明显。OsNIT1、OsNIT2的敲除不影响根系对外源施加NAA的响应。这些数据表明,能够被腈水解酶水解成IAA的IAN可能调节水稻根系生长。5.发现OsNIT1和OsNIT2突变会削弱外源IAN对水稻根系生长的影响。利用液相色谱分析了野生型,osnit1和osnit2突变体中IAN和IAA的浓度,结果显示水稻体内未能检测到IAN。发现OsNIT1‘OsNIT2突变体根中总IAA浓度较野生型没有显著差异,表明OsNIT1和OsNIT2在水稻幼苗IAA合成或积累中不起主要作用。此外,[3H]-IAA同位素示踪实验结果显示,无论供铵或供硝条件下,osnit1和osnit2突变体在距根尖0-3 cm处[3H]-IAA含量较野生型下降。该结果表明OsNIT1、OsNIT2的敲除突变体向顶式极性运输IAA的能力较野生型减弱。qPCR结果表明,与野生型相比,osnit1和osnit2突变体根中OsPIN1c和OsPIN1d的表达会受到抑制,而OsPIN2,OsGH3-2,OsGH3-8和OsGH3-13的表达会上调。由此可以得到结论,OsNIT1和OsNIT2可以通过改变生长素向顶式的运输和局部分布,调节水稻根系的生长。6.体外酶活测定结果表明,OsNIT1具有独立水解IAN酶的活性,但单独的OsNIT2或OsNAR2.1均不具有这种活性。然而,在酶水解反应体系中,将OsNIT1和OsNIT2共表达,或是将OsNIT1、OsNIT2和OsNAR2.1三者一起共表达,OsNIT1水解IAN的活性可以分别提高3.2倍和5.3倍。这些结果表明,OsNAR2.1和两种NIT蛋白的相互作用在激活水稻腈水解酶活性过程中具有重要的生物学意义。7.无论是RT-qPCR还是原位杂交分析,结果均显示供铵可以强烈促进OsNIT1和OsNIT2在根尖处的表达,但不影响OsNAR2.1的表达丰度。较野生型,在供铵条件下,OsNIT1、OsNIT2的敲除会导致水稻出现主根变短,侧根密度下降的表型;OsNAR2.1的敲除没有显著差异。此外,OsNAR2.1和OsNIT2的双突变也显示出与osnit2相似的根表型,表明OsNAR2.1在根系生长对铵的响应中不参与调控NIT蛋白的功能。与野生型相比,在铵溶液中生长的osnit1和osnit2突变体的[3H]-IAA向顶式运输能力发生了变化,而在osnar2.1突变体中未观察到。这些现象都表明,在供铵条件下,OsNIT1和OsNIT2可以独立于OsNAR2.1来调节水稻根系生长。综上所述,OsNIT1和OsNIT2与OsNAR2.1的互作不会影响硝酸盐的吸收但会影响根系生长。OsNAR2.1和OsNIT2可以增强OsNIT1水解IAN成为IAA的能力。OsNIT1和OsNIT2的失活不影响总IAA含量,但会抑制IAA从根尖处向基部（根茎结合处）极性运输的能力。此外,在供铵条件下,OsNIT1和OsNIT2也能调控根系生长,且不依赖于OsNAR2.1,表明OsNAR2.1-OsNIT1/OsNIT2互作模式在水稻根系生长对铵和硝响应中起着十分关键的但具有不同的调控功能。