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近年来,由于抗生素的滥用而导致多重耐药的“超级细菌”的出现严重威胁到了全人类的健康,因此对于结构新颖和作用机制独特的新型抗生素的需求迫在眉睫。大黄、虎杖、杜仲、金银花和板蓝根等中草药不仅能通过抑制人体内病原体的繁殖来治疗感染性疾病,还能够促进人体内肠道益生菌的生长。研究表明中药中某些小分子活性化合物可以作为激发子,对微生物次级代谢产物的生物合成途径起到激活作用。微生物次级代谢产物提供了抗生素化合物的丰富来源,其中核糖体合成和翻译后修饰肽（ribosomal synthesis and post-translation modification peptides,RiPPs）显示出强大的抗生素活性,羊毛硫肽作为RiPPs家族中的重要成员之一,因其独特的结构与抑菌机制而倍受关注。链霉菌的次级代谢产物早已被认为是微生物药物天然产物的分子宝库,是药物先导化合物的重要来源,基因组挖掘表明链霉菌生产羊毛硫肽的潜力巨大,但在常规培养条件下有大量的基因簇处于“沉默”或者低表达的状态。因此,激活链霉菌中羊毛硫肽基因簇的研究是必要的。中药及其有效成分能够调控微生物次级代谢产物的生产与活性,但其作用机尚不清楚。因此研究中药对微生物次级代谢物的调控机制不仅有助于开发出更多新型活性化合物,而且能为研究小分子化合物激活微生物中沉默基因簇的作用机制提供理论依据。本论文研究内容主要分为三部分,首先从细菌基因组数据库中选取具有益生潜力的基因组,采用各种生物信息学方法进行次级代谢产物的生物合成基因簇（Biosynthetic gene clusters,BGCs）的挖掘、RiPPs分类和分析,绘制细菌RiPPs的BGCs谱。其次选取杜仲叶、大黄和虎杖的水提物为研究对象,以含有沉默RiPPs的BGCs的链霉菌菌株为例,采用中药与细菌共培养的方法研究中药是否具有激活“沉默的”RiPPs的BGCs的能力。最后以链霉菌CB02414中的一个I型羊毛硫肽生物合成基因簇作为研究对象对其进行了基因调控,包括利用异源表达、双向启动子的替换、基因敲除策略,探究中药水提物激活该基因簇的机制。具体研究内容及研究结果如下:1.羊毛硫肽的基因组挖掘与生物合成分析本文利用antiSMASH 5.0、BAGEL 3和RiPPMiner等在线生物信息学软件分别对195株细菌的基因组进行次级代谢物的挖掘,并对挖掘到的多种RiPPs的类型及其生物合成基因簇进行归类与分析,重点对挖掘到的羊毛硫肽的生物合成基因簇进行了前体肽的多序列对比以及生物合成基因的分析。研究结果表明,新一代益生菌（NGPs）包括拟杆菌属、栖粪杆菌属、厌氧丁酸菌属、普雷沃氏菌属、克里斯滕森菌属、梭菌属和阿克曼氏菌属共7个菌属,在这7个属的161株菌基因组中挖掘到的RiPPs类化合物的类型丰富但数量较少,仅在6株NGPs中发现了5个I型羊毛硫肽和一个Ⅱ型羊毛硫肽的BGCs。对比antiSMASH 5.0和BAGEL 3两个软件的预测数量与类型,发现链霉菌中羊毛硫肽不仅类型丰富而且基因簇数量多,在34株链霉菌中使用antiSMASH 5.0预测到了132个羊毛硫肽的BGCs,其中Ⅲ型羊毛硫肽占比最多,Ⅴ型占比最少。对链霉菌CB02414中的一个I型羊毛硫肽的BGC进行具体分析,预测其完整的生物合成途径和可能的翻译后修饰结构,因此选择了对链霉菌进行中药水提物干预。2.中药水提物对链霉菌次生代谢物生产的影响选取杜仲叶水提物、大黄水提物和虎杖水提物作为待测试中药,采用中药提取物分别与链霉菌（Streptomyces sp.CB02414;Streptomyces sp.CB03234;Streptomyces sp.CB02130和Streptomyces sp.NRRL S-1813）共培养发酵的方法,将中药水提物按不同浓度比例加至液体培养基中与链霉菌共发酵七天后进行发酵产物的提取,通过高效液相色谱和液相-质谱联用技术对四株链霉菌的次级代谢产物差异性进行分析,并采用药敏片扩散法测定发酵液粗体物的抑菌活性。研究结果表明,在中药水提物的干预下四株链霉菌的代谢物对大肠杆菌没有抑制作用,而对金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌具有明显的抑制作用。与不加中药干预组相比,大黄水提物和虎杖水提物对四株链霉菌发酵液的粗提物的差异并不显著,但共培养的发酵产物有微弱的抑菌活性。杜仲叶水提物可显著促进链霉菌的次级代谢产生新的化合物,并且能促进其代谢物的抗菌活性。3.中药水提物促进链霉菌CB02414产Planosporicin-like的调控机制研究在第一章中通过基因组挖掘发现了链霉菌CB02414中存在一个潜在的I型羊毛硫抗生素（Planosporicin-like）的前体肽合成基因,但研究发现该菌的发酵液对藤黄微球菌的抑菌活性较弱。虽然杜仲叶水提物具有促进链霉菌代谢物产生的作用,但代谢产物的抑菌活性较弱。本章首先采用大肠杆菌BL21进行异源表达检测转运酶LanT、原宿主链霉菌CB02414中利用CRISPR-Cas9系统进行核心肽双向启动子的替换、同源重组技术进行负调控基因的敲除lanW等策略,明确激活该基因簇并使其高产或抑菌活性增强的基因靶点,而后采用杜仲叶水提物干预后检测抑菌活性,明确了该靶点对杜仲叶水提物促进链霉菌CB02414产Planosporicin-like的关键作用。研究结果表明,转运酶LanT不能再大肠杆菌BL21中有效的异源表达,核心肽中的双向启动子替换对Planosporicin-like的生产与抑菌活性没有显著影响,敲除基因簇中的负调控基因lanW的突变株ΔlanW对藤黄微球菌的抑菌活性明显增强。因此lanW为链霉菌CB02414生产Planosporicin-like的关键调控基因。与野生型菌株相比,杜仲叶水提物对突变株ΔlanW的抑菌活性具有促进作用。因此Lan W是杜仲叶水提物促进链霉菌CB02414产Planosporicin-like的重要调控因子。综上所述,本研究通过基因组挖掘发现新一代益生菌与链霉菌具有生产RiPPs化合物的潜力,链霉菌生产羊毛硫肽的潜力更高。采用中药水提物与链霉菌共培养发酵的方法确定了杜仲叶水提物具有提高链霉菌代谢物抑菌活性的能力。对链霉菌CB02414中的一个I型羊毛硫肽的BGC进行了基因改造,突变株ΔlanW具有明显的抑菌活性。本研究为链霉菌以及新一代益生菌次级代谢产物的研究奠定了分子基础,为中药对链霉菌次生代谢产物的调控机制的相关研究提供参考依据。