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第一部分IL-35在口腔鳞状细胞癌中的表达及临床意义目的检测白细胞介素35（Interleukin 35,IL-35）的两个亚基IL12A（IL-12 alpha）和EBI3（Epstein–Barr virus-induced gene 3）在口腔鳞状细胞癌组织中的表达,及其与口腔鳞癌患者临床病理特征和预后关系。材料和方法1.收集2008年-2012年期间于武汉大学口腔医院病理科诊断为口腔鳞癌的病例186例,对其进行IL12A和EBI3免疫组织化学检测。2.将染色切片扫描成数字病理图像,利用Aperio Image Scope软件分析IL12A和EBI3染色强度。每个组织点各选择4个部位进行分析,对结果进行记录并整理。3.利用TCGA数据库,收集494例头颈鳞癌患者IL12A和EBI3的表达和临床信息,用于后续分析。4.运用卡方检验分析IL12A和EBI3的表达强度,应用Kaplan-Meier方法对患者生存情况进行分析,IL12A和EBI3在口腔鳞癌中表达的相关性采用Spearman分析,并对结果进行讨论。5.应用q RT-PCR和Western Blot检测HIOEC,Cal27,HSC3,SCC25和SCC23中IL12A和EBI3的表达水平。6.应用慢病毒包装系统构建EBI3敲减的HSC3细胞系,并检验IL12A和EBI3基因敲减效率。7.应用CCK-8实验,检测EBI3敲减对OSCC细胞系增殖能力的影响。结果1.IL12A和EBI3在肿瘤组织细胞中广泛表达,且表达显著高于正常上皮（P＜0.001）。在靠近肿瘤的正常上皮中部分细胞表达IL12A和EBI3,并在异常上皮中表达增强。IL12A和EBI3在淋巴结转移肿瘤组织中的表达与原发灶相似,表达水平无显着差异。2.与HIOEC相比,IL12A在HSC3和SCC23细胞系中明显上升,分别升高了5.87和6.49倍;EBI3在CAL27、HSC3、SCC25和SCC23细胞系中都升高,分别升高了1.24、1.58、1.30、1.61倍。3.IL12A和EBI3在口腔鳞癌组织中表达呈正相关,具有相关性（P＜0.01,r=0.45）。4.对IL12A和EBI3免疫组化结果进行生存分析,IL12A和EBI3高表达组的5年生存率更低（P＜0.05）。TCGA数据分析,IL12A和EBI3高表达组十年无病间期更短（P＜0.05）。5.IL12A和EBI3在口腔鳞癌组织中的表达在病理学分级上有显着差异（P＜0.05）;在性别、年龄、肿瘤直径、淋巴结转移、远处转移和临床分期中,差异无统计学意义。6.与对照组细胞系相比,HSC3-EBI3-sh1/sh2细胞系IL12A分别降低了87%和58%,EBI3分别降低了82%和71%。CCK-8实验结果显示,与对照组比较,在96h,HSC3-EBI3-sh1/sh2敲减组的增殖活性下降37%和35%。结论IL-35的亚基IL12A和EBI3在口腔鳞癌中表达上升并具有相关性,IL12A和EBI3表达与患者病理分级呈正相关,是口腔鳞癌不良预后因素。第二部分IL-35对口腔鳞状细胞癌肿瘤微环境的影响目的前期实验结果表明IL12A和EBI3的高表达与口腔鳞癌的不良预后有关,通过研究IL12A和EBI3对口腔鳞癌肿瘤微环境的影响,探讨IL-35影响口腔鳞癌预后的可能机制。材料和方法1.使用TIMER2.0数据库计算IL12A和EBI3表达量对T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞浸润情况的影响。2.利用TIMER数据库分析IL12A和EBI3与PD1/PD-L1的表达相关性。3.应用免疫组化技术,在连续切片的组织芯片上对TIMER2.0数据库显示受IL12A和EBI3影响的CD4+T细胞进行染色分析;中性粒细胞结果为数字切片观察计数。4.采用SPSS21.0统计软件对数据进行分析,计数资料用卡方分析,生存分析用Kaplan-Meier方法。相关性分析用Spearman分析,P值＜0.05被认为具有统计学意义。结果1.TIMER2.0数据库数据显示,IL12A高表达会引起CD8+T细胞和B细胞比例降低,CD4+T细胞和中性粒细胞比例上升。EBI3高表达会引起CD8+T细胞和N细胞比例降低,CD4+T细胞、DC细胞和中性粒细胞比例上升。2.IL12A/EBI3和PD-1/PD-L1在HNSC中呈正相关,其中IL12A与PD1/PD-L1相关系数分别为0.438和0.236,p小于0.01;EBI3与与PD1/PD-L1相关系数分别为0.701和0.361,p小于0.01。3.对课题组前期进行的186例口腔鳞癌组织芯片进行免疫组化分析,发现EBI3与中性粒细胞浸润程度呈显着正相关（P＜0.0001,r=0.311）;IL12A与CD4+T细胞的浸润呈弱正相关（P=0.0316,r=0.254）。4.根据186例OSCC组织芯片中IL12A和EBI3蛋白的免疫组化表达强弱,以及中性粒细胞（N）和CD4+T细胞在肿瘤组织中的浸润程度,将其分别划分为高表达或高浸润组（+）和低表达或低浸润组（-）。将EBI3与中性粒细胞的不同分组进行组合分类后做预后分析。结果显示中性粒细胞高浸润且EBI3低表达组预后最好,其余三组之间无明显差异。将IL12A与CD4+T的不同分组进行组合分类后行预后分析,组织芯片数据显示CD4+T细胞高浸润、IL12A高表达组（CD4+T+IL12A+）预后最差（P＜0.0001）。结论IL-35的两个亚基IL12A和EBI3影响免疫细胞在口腔鳞癌中的浸润,影响口腔鳞癌的预后。