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目的:SD大鼠脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)后,抑制高迁移率族蛋白B1(High Mobility Group Box1,HMGB1)释放,观察脊髓损伤部位中星形胶质细胞(Astrocytes,Ast)极化相关蛋白的表达,轴突生长情况与运动功能的恢复情况。通过对体外培养的大鼠Ast进行划痕损伤,观察星形胶质细胞极化与HMGB1、Cdc42、α-Actinin4蛋白表达情况,探讨HMGB1对大鼠SCI后星形胶质细胞极化引导轴突生长与运动功能恢复的作用及其机制。方法:观察大鼠脊髓1损伤后的星形胶质细胞极化情况以及轴突损伤情况。将SD大鼠分为6组:假手术组(sham组)、模型组SCI 12h、1d、3d、5d、7d组;使用改良Allen法建立SCI模型后,观察其星形胶质细胞极化情况与轴突损伤情况。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组大鼠SCI后外周血清中促炎因子HMGB1表达量;应用蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)检测各组大鼠SCI后不同时间点脊髓中HMGB1、GFAP、Cdc42表达情况;同时应用HE染色和改良Bielschowsky染色观察SCI后脊髓与轴突损伤情况。观察体外培养的星形胶质细胞划痕损伤后的形态变化情况。培养取自48h内新生的SD大鼠乳鼠的脊髓Ast,建立划痕损伤模型。实验共分为5组:正常组(Normal组,正常培养的大鼠脊髓Ast,不做任何处理)、划痕损伤6h(划痕损伤6小时的大鼠脊髓Ast)、划痕损伤12h(划痕损伤12小时的大鼠脊髓Ast)、划痕损伤24h(划痕损伤24小时的大鼠脊髓Ast)、划痕损伤48h(划痕损伤48小时的大鼠脊髓Ast)。通过光学显微镜观察各组星形胶质细胞的形态变化。此部分实验可以探究SCI后不同时间点中星形胶质细胞极化最明显的时间点,以支持后续实验。第二部分,探究抑制HMGB1后,大鼠脊髓Ast极化情况,轴突生长情况以及运动功能恢复情况。将SD大鼠分为4组:Sham组、SCI组、SCI+EP(HMGB1抑制剂丙酮酸乙酯)组、SCI+GL(HMGB1抑制剂甘草甜素)组,应用ELISA检测各组大鼠外周血清中促炎因子HMGB1的表达量;应用WB检测各组大鼠脊髓中HMGB1、GFAP、Cdc42、α-Actinin4的表达情况;同时应用改良Bielschowsky染色观察SCI后脊髓轴突生长情况;通过观察与测试评价各组大鼠运动功能恢复情况。观察抑制HMGB1后,体外培养的大鼠脊髓Ast的极化情况。利用转染携带HMGB1沉默基因的慢病毒干扰细胞核部位蛋白的表达,并采用丙酮酸乙酯(EP)抑制HMGB1的表达。细胞分为6组:Normal组、Model组、外源性HMGB1组(Model+r HMGB1,细胞划痕后加入外源性HMGB1)、sh RNA转染组(Model+HMGB1sh RNA,正常星形胶质细胞与携带HMGB1沉默基因的慢病毒共同培养后进行细胞划痕)、阴性序列转染组(Model+non-targeting sh RNA,将正常星形胶质细胞与携带对HMGB1基因无影响的慢病毒共同培养后进行细胞划痕)以及Model+EP组(细胞划痕后加EP)。使用WB检测上述各组HMGB1、Cdc42、α-Actinin4表达情况,并通过光学显微镜观察各组星形胶质细胞的形态变化。第三部分,探讨大鼠SCI后抑制HMGB1对反应性星形胶质细胞引导轴突生长的可能机制。将大鼠分为6组:Sham组、SCI组、SCI+EP组、SCI+LPS(Toll样受体4激动剂脂多糖)组、SCI+LY(PI3K抑制剂LY294002)组、SCI+Casin(Cdc42抑制剂)组。WB检测各组大鼠脊髓组织中HMGB1、TLR4、PI3K以及Cdc42的表达量。应用改良Bielschowsky染色观察SCI后各组脊髓轴突生长情况。研究HMGB1通过Toll样受体4(TLR4)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路对大鼠脊髓Ast损伤后极化的调节作用。细胞分为6组:Normal组、Model组、Model+EP组、Model+CLI095(TLR4抑制剂)组、Model+LY组以及Model+Casin组。采用WB检测上述各组细胞中HMGB1、TLR4、PI3K、Cdc42、α-Actinin4的表达量,并通过光学显微镜观察上述各组细胞的形态变化。结果:1.第一部分实验中:ELISA结果显示:与Sham组相比,其余各组(进行了SCI的大鼠)血清中的HMGB1含量显著增高(P<0.05),且在SCI后1-3d,HMGB1含量达到峰值。WB结果显示:与未进行SCI的Sham组大鼠相比,SCI后不同时间点脊髓组织中HMGB1、GFAP、Cdc42表达量增高(P<0.05),且在SCI后3d时表达量最多。大鼠脊髓组织HE染色结果显示:Sham组可见脊髓组织结构完整性好;SCI后脊髓损伤部位结构不完整,组织结构紊乱。大鼠脊髓Bielschowsky染色结果显示:Sham组脊髓中轴突完整性好,无中断;SCI后脊髓中轴突连续性被破坏,轴突中断。此部分实验表明,SCI后3d脊髓中HMGB1、GFAP、Cdc42表达量最高,应该作为后续实验的典型时间点研究。在体外培养的大鼠脊髓Ast经过划痕损伤实验观察发现:与正常组相比,细胞在划伤后12h、24h、48h,均可见延伸向划痕部位的星形胶质细胞突起,其中24h组可见极化最明显,后续实验应作为典型时间点研究。2.第二部分实验中:动物实验观察抑制HMGB1后,对大鼠脊髓中HMGB1、GFAP、Cdc42、α-Actinin4表达的影响以及大鼠脊髓轴突生长和运动功能恢复的影响;细胞实验观察抑制HMGB1后脊髓星形胶质细胞的形态变化以及HMGB1、Cdc42、α-Actinin4表达情况。ELISA结果显示:与SCI组相比,EP组与GL组大鼠血清中HMGB1水平明显降低(P<0.05)。WB结果显示:与SCI组相比,EP组与GL组大鼠脊髓组织中HMGB1、GFAP、Cdc42、α-Actinin4的表达显著降低(P<0.05)。脊髓Bielschowsky染色结果显示:随SCI后时间延长,各组均有不同程度轴突生长,其中与SCI组相比,EP组与GL组的轴突生长明显增多。运动功能评价结果显示:SCI后随时间延长,各组斜坡试验与BBB评分均有所提高,其中与SCI组相比,EP组与GL组的斜坡实验、BBB评分显著增加(P<0.05)。这表明抑制HMGB1可下调大鼠脊髓中HMGB1、GFAP、Cdc42、α-Actinin4的表达,并有助于大鼠SCI后轴突生长与运动功能恢复。在体外培养的Ast实验中,WB结果显示:与Model组及外源性HMGB1组相比,sh RNA转染组和EP组的HMGB1、Cdc42、α-Actinin4表达减少(P<0.05),而阴性序列转染组与模型组相比蛋白表达量无明显差异(P>0.05)。光镜下观察星形胶质细胞发现:抑制HMGB1的EP组和sh RNA转染组的突起相比于模型组、外源性HMGB1组与阴性序列转染组明显减少(P<0.05)。这表明抑制HMGB1可降低大鼠脊髓Ast极性。3.第三部分实验中:观察HMGB1通过TLR4/PI3K/Cdc42通路对大鼠SCI后Ast极化的调节作用和对大鼠脊髓轴突生长的作用。WB结果显示:损伤脊髓组织中SCI组与SCI+LPS组的Cdc42、PI3K的表达较SCI+EP组、SCI+LY组、SCI+Casin组增多(P<0.05)。细胞实验中WB结果显示:与Model组相比Model+EP组、Model+CLI095组、Model+LY组及Model+Casin组中HMGB1、TLR4、PI3K、Cdc42蛋白表达减少(P<0.05)。在光镜下观察发现Model组较Model+EP组、Model+CLI095组、Model+LY组及Model+Casin组的星形胶质细胞突起增加。结论:抑制HMGB1能够减少大鼠SCI后GFAP及Cdc42表达,降低星形胶质细胞极化,可能通过TLR4/PI3K/Cdc42信号通路来发挥上述星形胶质细胞极化抑制作用,从而增加脊髓轴突生长,促进运动功能恢复。