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背景和目的在全球范围内,肺癌的发病率仅次于乳腺癌,且死亡率位居榜首。在肺癌的诊断中,非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer,NSCLC）占比高达85%。KRAS（Kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS）是包括肺癌在内的人类高致死率恶性肿瘤的重要致癌驱动基因,然而由于KRAS靶向抑制剂的开发难度较大,KRAS突变NSCLC的治疗面临着巨大的挑战。RNA m5C甲基化是重要的表观遗传学修饰,是近年来表观遗传学研究的前沿领域和热点,RNA m5C甲基转移酶NSUN2介导的m5C甲基化参与了如细胞分化、细胞增殖和细胞迁移等多种生物学过程,且NSUN2在膀胱癌,胆囊癌,食管癌等肿瘤组织中高表达,并以m5C依赖的方式参与调控多种肿瘤类型的发生发展。然而目前关于m5C在KRAS突变NSCLC中的分子机制未见报道。由此,本文旨在研究RNA m5C甲基转移酶NSUN2在KRAS突变的NSCLC的发生发展中的作用及其分子机制,以期为KRAS突变NSCLC提供新的治疗思路。方法1.通过公共数据库分析肺癌组织和KRAS突变的肺癌组织中NSUN2的基因表达水平,以及NSUN2的表达水平与患者生存率的相关性。2.收集临床KRAS突变NSCLC患者的癌与癌旁组织样本,利用免疫组化实验进一步验证NSUN2的蛋白表达情况。3.构建KRAS突变NSCLC细胞株H2122的NSUN2瞬时敲减细胞株,通过细胞增殖、细胞凋亡等细胞功能实验,分析NSUN2的敲低对细胞增殖、细胞凋亡等功能的影响。4.构建H2122的NSUN2稳定敲减细胞株,通过裸小鼠皮下移植瘤实验,在体内水平上分析NSUN2的敲低对肿瘤生长的影响。5.收集临床KRAS突变NSCLC患者的癌与癌旁组织样本,通过m5C亚硫酸氢盐测序（RNA bisulphite sequencing,RNA-Bisseq）和转录组测序（RNA sequencing,RNA-Seq）绘制mRNA m5C甲基化修饰分布图谱及研究m5C修饰与基因表达的关系。6.RNA-Bisseq联合RNA-Seq分析,筛选KRAS突变NSCLC患者的临床组织样本中NUSN2下游靶基因,并通过qPCR实验进一步筛选。分析靶基因在KRAS突变NSCLC组织样本测序数据和公共数据库中的表达水平及对患者预后的影响。7.构建KRAS突变NSCLC细胞株H2122的DPAGT1、NDUFS3靶基因的瞬时敲减细胞株,通过细胞增殖、细胞凋亡等细胞功能实验,分析DPAGT1、NDUFS3的敲低对细胞增殖、细胞凋亡等功能的影响。结果1.TCGA数据库结果显示,与正常组织样本相比,NSUN2在肺癌组织和KRAS突变的肺癌组织中显著高表达,并且NSUN2的高表达水平与肺癌患者的预后呈显著负相关。2.免疫组化结果显示,NSUN2在KRAS突变NSCLC癌组织中的蛋白表达水平高于癌旁。3.细胞增殖和流式细胞术实验结果显示,NSUN2在敲低后抑制了 KRAS突变细胞株H2122的增殖能力,并促进了 H2122细胞的凋亡。4.裸小鼠皮下移植瘤结果显示,敲低NSUN2显著抑制了 KRAS突变NSCLC细胞H2122的皮下移植瘤的生长。5.通过联合分析RNA-Bisseq和RNA-Seq的结果,绘制mRNA m5C甲基化修饰图谱,展示了 m5C分布的规律。6.通过RNA-Bisseq和RNA-Seq分析筛选出6个候选靶基因,分别是CHPF,DPAGT1,FAM220A,NDUFS3,PGP 和 ZNF692。通过 qPCR 进一步筛选得到DPAGT1,NDUFS3和PGP三个靶基因。通过公共数据库及测序数据分析发现,这三个靶基因在癌中高表达,且高表达水平与患者预后差呈正相关。7.细胞增殖和流式细胞术实验结果显示,敲低DPAGT1和敲减NDUFS3后均可抑制KRAS突变细胞株H2122的增殖能力,并均促进H2122细胞的凋亡。结论1.m5C甲基转移酶NSUN2在肺癌及KRAS突变NSCLC癌组织中较癌旁高表达,且NSUN2在肺癌中的高表达水平与患者的不良预后相关。2.敲减NSUN2抑制了 KRAS突变NSCLC细胞的增殖和皮下移植瘤的生长能力。3..DPAGT1,NDUFS3和PGP是m5C修饰在KRAS突变NSCLC中的下游靶基因,三者在癌中均较癌旁高表达,且高表达水平与患者的不良预后相关。敲减DPAGT1、NDUFS3后均可抑制KRAS突变NSCLC细胞的增殖能力。