胰岛素抵抗是多种慢性代谢紊乱的病理基础,如肥胖、心血管疾病、2型糖尿病和某些癌症等。磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（Protein kinase B,AKT）是胰岛素在糖代谢中最重要的信号传导途径。近年来,研究人员发现,细胞因子信号抑制因子1（Suppressor of cytokine signaling 1,SOCS1）是PI3K/AKT途径的一个重要的负调控因子。而骨骼肌作为机体影响葡萄糖代谢的一重要靶器官,SOCS1与其胰岛素抵抗方面的研究较少,寻找以SOCS1为靶点的药物可能为预防和治疗2型糖尿病提供新视野。白藜芦醇（Resveratrol,RSV）是一种由两个苯酚环组成的天然多酚类化合物。在70多种不同的植物中已经发现了RSV,葡萄（果皮和种子）、红酒、花生和大豆是其重要的食物来源。RSV具有多样化的生物活性,包括抗氧化、抗炎、抗肥胖和抗癌特性等,同时其提高胰岛素敏感性、降低血脂、调节血糖等作用受到越来越多的科学家们的关注。而RSV是否通过调节骨骼肌中SOCS1的表达改善胰岛素敏感性目前尚不清楚。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）是一类转录本长度大于200bp的RNA分子,参与如冠状动脉疾病、癌症、代谢性疾病、胰岛素抵抗等发生发展。我们课题组以前的研究发现,白藜芦醇可以通过调节小鼠的lncRNA提高肝脏胰岛素敏感性。然而,白藜芦醇是否通过调节骨骼肌中lncRNA的表达对胰岛素抵抗产生影响仍不清楚。最近,lncRNA被证实可以抑制miRNA的活性,增加miRNA的靶基因,并作为miRNA的竞争性内源RNA（Competing Endogenous RNA,ceRNA）。那么lncRNA能否通过ceRNA机制影响SOCS1以及白藜芦醇是否通过调控lncRNA来影响SOCS1表达改善胰岛素敏感性仍需进一步研究。因此本研究通过建立体内和体外骨骼肌胰岛素抵抗模型,验证白藜芦醇、lncRNA、SOCS1三者的关系,并通过对2型糖尿病患者外周血单核细胞SOCS1 mRNA表达的分析及血清炎症因子的测定,确定SOCS1表达与胰岛素抵抗的相关性,为2型糖尿病提供新的潜在治疗靶点。第一部分 白藜芦醇干预对高脂胰岛素抵抗小鼠骨骼肌lncRNA表达谱的影响目的:探讨白蔾芦醇对高脂饮食诱导的C57BL/6J小鼠糖脂代谢指标以及骨骼肌脂质沉积的影响,并应用高通量测序分析,检测应用白藜芦醇后高脂小鼠骨骼肌lncRNA表达谱的变化。方法:随机将C57BL/6J小鼠分为两组:对照组（CON）和高脂组（HFD）,饲养8周后所有小鼠进行腹腔注射葡萄糖耐量实验（IPGTT）。HFD组中选择14只作为干预组（HFD+RSV）,HFD+RSV组给予白藜芦醇100 mg/kg/d灌胃,CON组和HFD组给予相应剂量含0.1%二甲基亚砜（DMSO）的生理盐水。给药6周后,行第二次IPGTT实验,检测糖代谢指标:空腹血糖（FPG）、空腹胰岛素水平,并计算胰岛素敏感性指数（QUICKI）。测定脂代谢指标:总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。应用H＆E染色和油红O染色观察骨骼肌组织病理形态变化及脂肪沉积情况。从各组小鼠骨骼肌组织中提取总RNA,用于构建测序文库,并利用高通量测序技术进行转录组测序,识别差异表达的基因。然后通过实时聚合酶链反应（RT-qPCR）验证各组小鼠差异表达基因的相对表达水平。结果:1.高脂饮食建立小鼠胰岛素抵抗模型刚入组实验时CON组和HFD组小鼠体重无差异（P＞0.05）。高脂饲料喂养1周后,HFD组小鼠体重明显增加（P＜0.05）。两组小鼠IPGTT发现,HFD组小鼠在注射葡萄糖前、注射后30 min、60 min、120 min血糖均高于CON组（P＜0.05）,且HFD组AUC明显高于CON组（P＜0.05）,说明高脂饮食可以导致小鼠糖代谢异常。2.白藜芦醇应用6周改善小鼠体重及胰岛素抵抗与CON组相比,各时间点HFD组小鼠体重均升高（P＜0.05）,白藜芦醇应用后小鼠体重有下降趋势,3周后有统计学差异（P＜0.05）。各组小鼠每日摄食热量无差异。6周末行IPGTT实验,与CON组比较,HFD组小鼠在各个时间点血糖水平明显升高,与HFD组相比,HFD+RSV组在0 min、30 min、60 min、120 min血糖水平明显下降（P＜0.05）。与CON组相比,HFD组的AUC明显增加,与HFD组相比,HFD+RSV组的AUC明显减少（P＜0.05）。与CON组相比,HFD组的空腹血糖和胰岛素增加（P＜0.05）,白藜芦醇处理后下降（P＜0.05）。HFD组QUICKI值较CON组明显下降（P＜0.05）,白藜芦醇处理后升高（P＜0.05）,提示白藜芦醇可以明显改善高脂小鼠胰岛素敏感性。3.白藜芦醇应用6周改善高脂小鼠血脂水平HFD组与CON组相比,TG、TC、LDL-C水平显著升高（P＜0.05）,HFD+RSV组与HFD组相比TG、LDL-C水平明显降低（P＜0.05）,TC水平未见明显下降（P＞0.05）,而三组小鼠HDL-C水平无明显差异。4.三组小鼠骨骼肌组织的形态学H＆E染色结果发现CON组骨骼肌细胞结构完整,肌细胞之间排列紧密;HFD组骨骼肌结构松散,肌间隙增宽,细胞核大小不一,部分肌细胞空泡样变,肌间隙可见少量炎症细胞浸润。应用白藜芦醇后肌细胞损伤减轻。油红O染色显示CON组有少量的橘红色脂滴;在HFD组观察到大量橘红色脂滴;白藜芦醇处理后脂滴数量明显减少。5.小鼠骨骼肌lncRNA的表达谱小鼠骨骼肌组织中检测到总共58245个lncRNAs序列。HFD组与CON组相比有3276个差异表达的lncRNAs（1192个上调和2084个下调）。与HFD组相比,应用白藜芦醇后有1640个差异表达的lncRNAs（921个上调和719个下调）。在HFD组上调的lncRNAs中,有270个lncRNAs在应用白藜芦醇后被下调。而在HFD组下调的lncRNAs中,有359个lncRNAs在应用白藜芦醇后被逆转。维恩图显示,在HFD组和HFD+RSV组之间,629个lncRNAs被逆转。6.小鼠骨骼肌组织RT-qPCR验证4个lncRNAs。在筛选的测序结果中选取白藜芦醇逆转高脂诱导的胰岛素抵抗的lncRNA,2 个HFD组上调和HFD+RSV组下调的lncRNAs（NONMMU-T005295.2 和NONMMUT044897.2）以及 2 个HFD组下调和HFD+RSV组上调的lncRNAs（NONMMUT128951.1 和 NONMMUT145909.1）进行定量RT-qPCR检测。4个lncRNAs的表达水平与测序分析的结果一致,但在HFD+RSV组NONMMUT128951.1的增加无统计学差异（P＞0.05）。小结:高脂饮食诱导小鼠胰岛素抵抗及骨骼肌脂肪沉积,应用白藜芦醇可提高胰岛素敏感性及减轻脂肪沉积。白藜芦醇应用后逆转部分lncRNA的表达水平,提示lncRNA可能在白藜芦醇改善高脂诱导的小鼠胰岛素抵抗中发挥重要作用。第二部分 白藜芦醇干预对高脂胰岛素抵抗小鼠骨骼肌mRNA表达谱的影响目的:高通量测序分析探讨白藜芦醇对高脂小鼠骨骼肌mRNA表达谱的影响。通过GO和KEGG的富集分析,探讨应用白藜芦醇后差异表达的mRNA主要的生物学功能及信号传导途径。方法:利用高通量测序技术分析三组小鼠骨骼肌mRNA表达谱变化,并识别差异表达基因。用R软件包clusterProfiler对差异基因进行GO和KEGG富集分析。应用RT-qPCR测定胰岛素信号途径有关的分子SOCS1、AKT、GSK3β和GLUT4 mRNA的表达,通过蛋白质印迹法（Western blot）检测SOCS1、AKT、p-AKT、GSK3β和p-GSK3β蛋白表达水平。结果:1.小鼠骨骼肌中mRNA表达谱基因测序表明,在小鼠的骨骼肌中,总共发现83089个mRNAs序列。HFD组与CON组相比有2118个差异表达的mRNAs（314个上调和1804个下调）。与HFD组相比,应用白藜芦醇后有604个差异表达的mRNAs（444个上调和160个下调）。在HFD组上调的mRNAs中,有58个mRNAs被白藜芦醇逆转。HFD组下调的mRNAs中,有280个mRNAs被白藜芦醇逆转。维恩图显示,在HFD组和白藜芦醇应用后两组之间一共有338个mRNAs被逆转,其中SOCS1测序结果也显示在HFD组上调,应用白藜芦醇后下降。2.白藜芦醇逆转差异表达mRNAs的GO及KEGG分析通过富集分析研究了这些差异表达mRNAs的功能。最丰富的GO术语是“myelination,ensheathment of neurons,axon ensheathment,cellular component assembly involved in morphogenesis,transition between fast and slow fiber（生物过程）、myofibril,sarcomere,contractile fiber,compact myelin,contractile fiber part（细胞组件）”、以及“structural constituent of myelin sheath,actin binding,fatty acid synthase activity,ion gated channel activity,gated channel activity（分子功能）”。KEGG分析显示,差异表达mRNA主要参与JAK-STAT信号通路、趋化因子信号通路、组氨酸代谢、2型糖尿病、脂肪酸代谢等。KEGG分析表明,SOCS1在JAK-STAT信号通路和2型糖尿病中发挥重要作用。3.SOCS1及胰岛素信号通路相关基因mRNA水平RT-qPCR结果表明,HFD组小鼠骨骼肌SOCS1基因mRNA的表达水平显著高于CON组（P＜0.05）,应用白藜芦醇后逆转了SOCS1 mRNA水平（P＜0.05）。与CON组比较,HFD组小鼠骨骼肌GLUT4的mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）,应用白藜芦醇后GLUT4mRNA水平升高（P＜0.05）。AKT和GSK3β的mRNA表达水平三组间无明显差异（P＞0.05）。4.SOCS1和胰岛素信号通路相关蛋白表达Western blot实验表明,HFD组小鼠骨骼肌SOCS1的表达水平高于CON组（P＜0.05）,SOCS1蛋白在白藜芦醇干预后明显下降（P＜0.05）。三组之间AKT、GSK3β蛋白水平均未见差异性变化,而HFD组的磷酸化AKT、GSK3β水平显著低于CON组（P＜0.05）,应用白藜芦醇后两者表达水平恢复（P＜0.05）。此结果证明高脂会激活小鼠骨骼肌SOCS1表达,抑制胰岛素信号通路传导,白藜芦醇应用后提高了胰岛素敏感性。小结:白藜芦醇可以逆转多个被高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠骨骼肌的mRNA表达,这些被调节的mRNA多数与骨骼肌的糖脂代谢,或能量代谢有关。SOCS1是2型糖尿病通路主要差异基因。白藜芦醇对高脂小鼠骨骼肌SOCS1基因表达影响较大,为深入研究白藜芦醇通过影响SOCS1/AKT/GSK3β通路而改善胰岛素敏感性提供了方向。第三部分 白藜芦醇通过lncRNA-NONMMUT 044897.2抑制SOCS1的细胞学水平验证目的:利用lncRNA-miRNA-mRNA共表达网络的建立,在细胞层面上研究筛选出的lncRNA在白藜芦醇对骨骼肌胰岛素抵抗的影响。方法:利用lncRNA-miRNA-mRNA共表达网络及KEGG富集分析,结合测序结果,筛选出与SOCS1关系密切的lncRNA NONMMUTO-44897.2。利用RT-qPCR技术,测定经过慢病毒载体转染的C2C12细胞NONMMUT044897.2的水平,评估转染效果。将C2C12细胞分为五组:对照组（CON）、PA组（PA）、PA+shRNA-NONMMUT044897.2 阴性对照组（shRNA-NC）,PA+shRNA-NONMMUT044897.2 敲低组（shRNA-NONMMUT044897.2）和PA+RSV 30 μM组（RSV）。给予相应组PA和白藜芦醇孵育,24 h后提取总蛋白,每孔加入胰岛素储存液5.7μl,20 min后提取细胞蛋白,并用免疫印迹法测定目的基因的表达。结果:1.LncRNA-miRNA-mRNA共表达网络NONMMUT044897.2在被验证的lncRNA中具有较高的表达量,为了阐明NONMMUT044897.2与SOCS1之间的关系,使用Cytoscape软件构建了 ceRNA网络图。结果表明,NONMMUT044897.2海绵作用于miR-7051-5p和miR-762调控SOCS1表达。使用miRcode和starBase数据库,证明NONMMUT044897.2 包含 miR-7051-5p 的结合序列。根据 TargetScan 和starBase数据库的信息,SOCS1可能是miR-7051-5p的靶基因。2.细胞分化成功标志2%马血清对C2C12细胞诱导分化4天后,梭状成肌细胞彼此相聚合,逐渐形成肌管束;结蛋白（desmin）和肌细胞生成素（myogenin）mRNA的表达水平显著升高（P＜0.05）,说明成功分化C2C12细胞。3.敲低NONMMUT044897.2对胰岛素信号途径的影响与PA组相比,沉默NONMMUT044897.2 后提高了p-AKT、p-GSK3β和GLUT4蛋白水平,并大大降低了SOCS1蛋白水平。在NONMMUTO-44897.2沉默对p-AKT、p-GSK3β、GLUT4和SOCS1蛋白水平的影响方面,应用RSV后有类似的效果。以上结果表明,白藜芦醇改善胰岛素抵抗的作用机制可能与其下调NONMMUT044897.2表达有关。小结:白藜芦醇通过抑制SOCS1,激活AKT/GSK3β/GLUT4信号通路改善棕榈酸诱导的C2C12细胞胰岛素抵抗。白藜芦醇通过降低lncRNA NONMMUT044897.2的表达水平,从而抑制SOCS1,提高胰岛素敏感性。第四部分 2型糖尿病患者外周血单核细胞SOCS1 mRNA及血清炎症因子的分析目的:通过测定2型糖尿病患者外周血单核细胞SOCS1 mRNA表达及血清炎症因子的水平,确定外周血单核细胞SOCS1 mRNA表达与胰岛素抵抗的相关性。方法:选取2019年12月～2021年3月在我院就诊的初发2型糖尿病患者（T2DM）50例作为研究对象。纳入标准:1)符合2017年版《中国2型糖尿病防治指南》2型糖尿病诊断标准;2)初诊患者;3)肝、肾、心脏等重要器官功能正常;4)年龄18-80岁。排除标准:1)有其他类型的糖尿病;2)有急慢性的糖尿病并发症;3)有感染性疾病;4)严重的全身性疾病;5)6个月内有重大创伤、手术、肿瘤;6)长期服用激素。同期选取在体检中心查体的健康人群50例为健康对照组（NC）。收集受试者的一般资料,如年龄、性别、病程、吸烟史、饮酒史、家族史;均禁食水8h后于次日清晨测量身高、体重、计算体重指数BMI,抽血化验空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、血脂、空腹胰岛素,计算胰岛素抵抗指数,同时测定肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、C反应蛋白（CRP）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）及RT-qPCR测定外周血单核细胞细胞因子信号抑制因子1（SOCS1）水平,并进行炎症因子与胰岛素抵抗相关性分析。结果:1.一般临床资料比较（mean±SD）经统计学分析,NC组和T2DM组之间年龄、性别无明显差异。与NC组比较,T2DM组BMI、TC、TG、LDL-C、HbA1c、FBG、HOMA-IR、SOCS1、CRP、IL-6、TNF-α、MCP-1明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05）,HDL-C在两组间无明显变化。2.炎症因子与胰岛素抵抗指数相关性分析Spearman相关性分析表明,2型糖尿病患者血清炎症因子CRP、IL-6、TNF-α、MCP-1与胰岛素抵抗指数均呈正相关（P＜0.01）。2型糖尿病患者外周血单核细胞SOCS1表达与胰岛素抵抗指数均呈正相关（P＜0.01）。2型糖尿病患者外周血单核细胞SOCS1表达与血清其他炎症因子CRP、IL-6、TNF-α、MCP-1 呈正相关（P＜0.01）。小结:1.2型糖尿病患者体内血糖、血脂、HOMA-IR、SOCS1及炎性因子IL-6、TNF-α、CRP、MCP-1 水平明显升高。2.外周血单核细胞SOCS1、炎性因子（IL-6、TNF-α、CRP、MCP-1）水平与胰岛素抵抗指数呈正相关。结论:1.高通量测序发现白藜芦醇通过多个方面改善高脂饮食小鼠的骨骼肌基因表达谱,且和胰岛素信号通路相关。2.白藜芦醇可通过降低骨骼肌lncRNANONMMUT044897.2水平,达到抑制SOCS1作用,进一步激活AKT/GSK3β/GLUT4信号通路从而改善胰岛素抵抗。3.外周血单核细胞SOCS1 mRNA的表达水平可作为新的反应胰岛素抵抗的生物标志物深入研究。