【摘 要】
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循环肿瘤DNA是起源于肿瘤或循环肿瘤细胞的单链或双链DNA片段,可提供肿瘤的准确分子特征,因此实现循环肿瘤DNA的灵敏检测对临床诊断和突变分析等方面都具有重要意义。其中BRAF V600E基因与乳头状甲状腺癌的侵袭性行为、疾病复发和疾病特异性死亡率有关。本实验选取BRAF V600E基因序列作为体外检测靶目标物,建立了将三维DNA步行器和CRISPR/Cas12a结合的荧光检测策略。靶DNA存在时
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循环肿瘤DNA是起源于肿瘤或循环肿瘤细胞的单链或双链DNA片段,可提供肿瘤的准确分子特征,因此实现循环肿瘤DNA的灵敏检测对临床诊断和突变分析等方面都具有重要意义。其中BRAF V600E基因与乳头状甲状腺癌的侵袭性行为、疾病复发和疾病特异性死亡率有关。本实验选取BRAF V600E基因序列作为体外检测靶目标物,建立了将三维DNA步行器和CRISPR/Cas12a结合的荧光检测策略。靶DNA存在时,三维DNA步行器可实现对靶DNA的识别和结合,在特异性核酸内切酶的辅助下通过循环剪切释放大量的输出DNA,该输出DNA可特异性结合CRISPR-cr RNA并进一步激活Cas12a蛋白的非特异性反式切割活性,最后检测荧光信号强度。这种不依靠DNA聚合酶的扩增方法可以在1 f M-20 n M范围内检测BRAF V600E,检测限为0.37 f M。由于三维DNA步行器具有强大的的扩增能力以及CRISPR/Cas12a具有较高的特异性和可编程性,整个过程最多只需70分钟。总之,该方法不仅为循环肿瘤DNA的快速检测提供了一个平台,而且在早期临床诊断和生物医学研究方面也显示出了良好的潜力。
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