目的:缺血性心脏病（Ischemic heart disease,IHD）是最常发生的与心血管相关的疾病,是全世界导致死亡的主要原因,全球每年死于IHD的人数超过750万人。及时进行再灌注治疗是目前最常用也是最有效治疗缺血性心肌病的方法。但在再灌注治疗过程中,可能发生心肌损伤加剧的情况,即发生了心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI）。心肌缺血再灌注损伤是临床上常见的影响缺血性心肌病患者治疗效果甚至导致患者死亡的原因之一。MIRI的发生发展机制较为复杂,涉及多种机制。既往研究表明,微小RNA（microRNA,miRNA）在心肌缺血再灌注过程中表达发生变化,并参与调控MIRI的发生与发展,而microRNA（miR）-23a就是一种参与调控MIRI过程的重要因子,但其具体机制尚不清楚。本研究主要探讨miR-23a在心肌缺血再灌注损伤中的作用及其分子机制。综上所述,本研究为了明确miR-23a在心肌缺血再灌注损伤中的作用,以大鼠H9c2心肌细胞和大鼠离体心脏作为研究对象,通过构建心肌细胞缺氧复氧模型及离体大鼠心脏缺血再灌注模型,对以下两部分内容进行研究:（1）通过比较正常组和缺血再灌注损伤组的心肌细胞和心肌组织的明确miR-23a在心肌缺血再灌注损伤中的表达变化情况,并通过观察和比较应用miR-23a模拟物或抑制物在缺氧复氧损伤心肌细胞中过表达或抑制miR-23a对缺氧复氧损伤心肌的影响,明确miR-23a在缺血再灌注损伤中的作用;（2）观察和对比应用miR-23a抑制物在心肌细胞内抑制miR-23a的表达,对RISK和SAFE通路的影响,进而探讨抑制miR-23a表达对心肌保护作用的可能的作用机制。研究方法:1、应用Langendorff装置,对Wistar大鼠进行离体心脏灌流,建立离体大鼠心脏血再灌注模型,使用HE染色观察心肌组织损伤情况,TTC染色观察心肌组织缺血坏死情况。应用电子透射显微镜观察缺血再灌注损伤心肌组织的亚显微结构的变化情况。应用H9c2细胞在三气培养箱中（37℃,3%O2,5%CO2,92%N2）,建立缺氧复氧模型。使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测不同时间点下心肌细胞的存活率。RT-qPCR明确缺血再灌注损伤心肌组织和缺氧复氧心肌细胞内miR-23a的表达变化情况。2、将正常条件（37℃,5%CO2）培养的H9c2细胞于H9c2细胞中进行转染miR-23a模拟物（mimic）和抑制物（inhibitor）,转染后48小时,进行缺氧复氧损伤（37℃,3%O2,5%CO2,92%N2）。CCK-8检测细胞活性变化,流式细胞术检测细胞凋亡情况。LDH和CK-MB检测心肌细胞的心肌酶变化情况。3、通过鼠尾静脉注射miR-23a-sponge和空白对照（NC）腺相关病毒,抑制Wistar大鼠心肌内的miR-23a表达,3周后应用Langendorff装置进行离体灌流,构建缺血再灌注损伤模型。应用HE染色检测心肌组织形态变化,TTC染色检测心肌梗死情况。TUNEL染色检测心肌凋亡情况。4、应用双荧光素酶报告验证miR-23a与Rap1a之间存在靶向关系。对H9c2细胞进行转染,对转染miR-23a mimic和miR-23a inhibitor及相应NC对照的心肌细胞进行缺氧复氧处理。RT-qPCR检测心肌细胞中的Rap1a的m RNA表达变化情况。使用Western-blot对心肌细胞中的Rap1a表达水平进行检测。5、对H9c2细胞进行Rap1a ORF和Vector转染,过表达Rap1a,应用Western-blot检测Rap1a蛋白表达变化情况。使用CCK-8检测细胞活性变化,流式细胞术检测细胞凋亡情况。使用Western-blot检测过表达Rap1a的缺氧复氧心肌细胞中线粒体凋亡蛋白cleaved-caspase3,cleaved-caspase9及心肌细胞抗凋亡通路AKT,ERK1/2,STAT3和JAK2等蛋白的磷酸化水平。6、应用Western-blot检测缺氧复氧心肌细胞中抑制miR-23a表达对线粒体凋亡蛋白cleaved-caspase3,cleaved-caspase9 Cyt C表达的影响情况。以及心肌细胞抗凋亡通路中AKT,ERK1/2,STAT3和JAK2等蛋白的磷酸化水平的变化情况。使用MPTP检测试剂盒和JC-1试剂盒检测缺氧复氧心肌细胞中抑制miR-23a表达对线粒体膜电位变化的影响。结果:1、缺血再灌注损伤可以诱导H9c2细胞和心肌组织的miR-23a表达升高,且升高幅度与心肌损伤严重程度呈正相关。2、H9c2细胞中转染miR-23a mimic,与转染空载组对比,转染miR-23a mimic会加重缺氧复氧心肌细胞的损伤,细胞活性降低,凋亡率升高,心肌酶释放增多,相反转染miR-23a inhibitor会减轻缺氧复氧导致的心肌细胞损伤。3、心肌组织中转染miR-23a inhibitor,与转染NC组相对比,转染miR-23a inhibitor可以明显减轻心肌缺血再灌注损伤,心梗面积减少,心肌组织损伤减轻,心肌凋亡率减低。4、心肌细胞中转染miR-23a mimic可以减少Rap1a的表达,而转染miR-23a inhibitor可以增加心肌细胞中Rap1a的表达。5、H9c2细胞中转染Rap1a ORF克隆质粒,与转染空载组相比,转染Rap1a ORF克隆质粒可以减轻心肌缺氧复氧损伤,减少细胞凋亡,降低线粒体凋亡相关蛋白表达,增加AKT、JAK2、ERK1/2和STAT3的磷酸化水平。6、H9c2细胞中转染miR-23a inhibitor,与转染NC组相比,凋亡相关蛋白表达降低,AKT、JAK2、ERK1/2和STAT3的磷酸化水平增加,线粒体膜电位降低水平受到抑制。结论:1、miR-23a在缺血再灌注损伤心肌中表达升高并促进心肌损伤,抑制miR-23a表达可以减轻缺血再灌注损伤程度。2、miR-23a可以通过靶向结合Rap1a 3’UTR,抑制其表达。3、抑制miR-23a表达可能通过激活RISK及SAFE通路,进而抑制线粒体凋亡通路的激活,减轻MIRI