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目的:女性随着围绝经期的到来,卵巢功能开始丧失,其体内性激素会发生巨大改变,最主要的表现为雌激素水平下降。流行病学调查发现,绝经后的女性发生糖尿病、血脂异常、胰岛素抵抗以及各种并发症的概率明显高于男性,而进行雌激素替代治疗后情况在一定程度上有所改善。以上信息揭示雌激素与糖代谢之间有一定关联,但目前国内外对于雌激素的降低导致糖尿病风险增高的分子机制研究并不深入,没有确切定论,因此本实验旨在研究雌激素对胰岛β细胞功能的分子机制研究。雌激素是一类类固醇化合物,具有广泛的生物活性,包括三种不同类型:17β-雌二醇（17β-estradiol,E2）、雌酮（estrone,E1）及雌三醇（estriol,E3）,其中雌二醇的含量最多,生理活性最高。G蛋白偶联雌激素受体（G-protein coupled estrogen receptor,GPER）是一种七次跨膜G蛋白偶联受体,能介导雌激素的快速非基因组效应,间接调节基因表达并发挥多种生物学功能。有报道提示雌激素通过GPER受体保护了胰岛β细胞的功能,但关于雌激素通过GPER受体如何保护胰岛β细胞功能还有待研究。因此本课题就此问题进行以下探讨。雌激素具有抗氧化应激的作用,可以保护线粒体的功能,降低过多的活性氧（reactive oxygen species,ROS）对组织和细胞损伤。因此研究雌激素对线粒体功能的作用机制成为治疗的一个新靶点。真核细胞在线粒体中进行生物氧化和能量转换,涉及各种生物过程,例如细胞稳态,增殖,运动,衰老和死亡。线粒体自噬是一种选择性自噬,可去除多余或损坏的线粒体,在维持线粒体的数量和正常功能中起着重要作用。几项研究均表明大量ROS的产生可以诱导自噬的发生,特别是线粒体自噬。由此可知ROS的过多会导致线粒体自噬的增加,而雌激素的抗氧化应激作用可以抑制线粒体自噬的发生从而避免细胞损伤。基于上述信息,我们猜测雌激素可能通过调控线粒体自噬从而保护胰岛β细胞功能。而雌激素通过何种途径调控线粒体自噬还需深入研究。目前发现GPER参与信号转导的调节机制主要包括PI3K/Akt通路、cAMP/PKA通路、EGFR/MAPKs通路等。有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）参与细胞的运动、凋亡、增殖分化等许多生理和病理过程。P38MAPK作为MAPK家族一员,影响下游信号因子信号传导及转录激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription,STAT3）参与基因调控。而STAT3可以抑制线粒体自噬的发生。因此推测雌激素可能通过p38MAPK/STAT3信号通路调控线粒体自噬,从而改善胰岛β细胞的功能。综上所述,本研究将采用体外和体内实验来证明雌激素是否通过GPER-p38MAPK/STAT3信号通路干预线粒体自噬从而影响胰岛β细胞功能,深入了解雌激素对糖代谢的分子作用机制,为糖尿病的诊治奠定理论基础。研究方法:第一部分E2及GPER对大鼠胰腺组织和INS-1细胞功能的影响将SD（Sprague Dawley）雌性大鼠随机分配为3组:假手术组（Sham组）、卵巢切除术组（Ovariectomy,OVX组）、卵巢切除术后给药组（OVX+E2组）,给药组E2处理8周后,留取胰腺组织及血清,应用免疫荧光（Immunofluorescence）、蛋白质印迹法（Western blot,WB）及实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测胰腺组织中GPER的蛋白和mRNA表达;葡萄糖氧化酶试剂盒检测腹腔内葡萄糖耐量（Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT）;酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测胰岛素分泌水平。在正常培养基的培养下,将大鼠胰岛细胞瘤细胞（Insulinoma cell line,INS-1）分为对照组、E2组、G15组（GPER拮抗剂）、E2+G15组,处理细胞24h后应用Western blot及real-time PCR检测GPER的蛋白和m RNA表达;葡萄糖摄取率试剂盒检测葡萄糖摄取率,ELISA试剂盒检测胰岛素分泌水平。第二部分线粒体自噬在E2调节大鼠胰腺组织及INS-1细胞功能中的作用将SD雌性大鼠随机分配为3组:Sham组、OVX组、OVX+E2组,给药组E2处理8周后,留取胰腺组织,应用Western blot检测胰腺组织中微管相关蛋白1轻链3（Microtubule-activated protein 1 light chain 3,LC3）、热休克蛋白60（Heat shock protein 60,Hsp60）、线粒体外膜蛋白20（Mitochondrial translocase of outer membrane complex 20,TOM20）蛋白表达;免疫荧光检测TOM20和溶酶体关联膜蛋白Ⅱ（Recombinant Lysosomal Associated Membrane Protein Ⅱ,Lamp Ⅱ）的共定位表达。在正常培养基的培养下,INS-1细胞分为对照组、E2组,处理细胞24h后应用透射电镜观察INS-1细胞中线粒体自噬体的形成;Western blot检测LC3、Hsp60、TOM20蛋白表达;real-time PCR检测人死骨片1-泛素结合蛋白p62（SQSTM1-p62）、TOM20、Hsp60 m RNA表达。在正常培养基的培养下,INS-1细胞分为对照组、E2组、CCCP（线粒体自噬诱导剂）组、E2+CCCP组,处理24h后应用葡萄糖摄取率试剂盒检测葡萄糖摄取率;ELISA试剂盒检测胰岛素分泌水平。第三部分p38MAPK/STAT3信号通路在E2调节INS-1细胞功能中的作用在正常培养基的培养下,INS-1细胞分为对照组、E2组、G15组、SB203580（p38MAPK拮抗剂）组、Stattic（STAT3拮抗剂）组,处理24h后应用Western blot检测GPER、p-p38MAPK/p38MAPK、p-STAT3/STAT3、LC3、TOM20、Hsp60蛋白表达;real-time PCR检测p62、TOM20、Hsp60 m RNA表达;葡萄糖摄取率试剂盒检测葡萄糖摄取率;ELISA试剂盒检测胰岛素分泌水平。实验结果:第一部分E2及GPER对大鼠胰腺组织和INS-1细胞功能的影响1.SD大鼠胰腺组织及INS-1细胞中有GPER受体的存在。2.E2可以上调SD大鼠胰腺组织和INS-1细胞中GPER受体活性,G15拮抗剂可以阻断E2对GPER的功能。3.与Sham组相比,OVX组GPER蛋白表达及m RNA表达均减少,血糖值较Sham组升高但无显著差异,胰岛素分泌水平明显增高。与OVX组相比,OVX+E2组GPER蛋白表达及m RNA表达均增加,血糖值较OVX组下降但无显著差异,胰岛素分泌水平明显下降。4.在INS-1细胞中与对照组相比,E2组GPER蛋白表达及m RNA表达均增加,葡萄糖摄取率及胰岛素分泌水平均增高;G15组GPER蛋白表达及m RNA表达均下降,葡萄糖摄取率及胰岛素分泌水平均降低。与E2组相比,E2+G15组蛋白表达及m RNA表达均下降,葡萄糖摄取率及胰岛素分泌水平均降低。第二部分线粒体自噬在E2调节大鼠胰腺组织及INS-1细胞功能中的作用1.与Sham组相比,OVX组LC3-Ⅱ蛋白表达增加,TOM20及Hsp60蛋白表达减少。TOM20和LAMP Ⅱ阳性颗粒共定位表达增多。与OVX组相比,OVX+E2组LC3-Ⅱ蛋白表达减少,而TOM20及Hsp60蛋白表达增加。TOM20和LAMP Ⅱ阳性颗粒共定位表达减少。2.在INS-1细胞中与对照组相比,E2组线粒体自噬体的形成减少;LC3-Ⅱ蛋白表达减少,而TOM20和Hsp60蛋白表达增加;p62、TOM20以及Hsp60 m RNA表达均增加。3.在INS-1细胞中与对照组相比较,E2组葡萄糖摄取率及胰岛素分泌水平增高,CCCP组葡萄糖摄取率及胰岛素分泌水平降低。与E2组相比,E2+CCCP组葡萄糖摄取率及胰岛素分泌水平降低。第三部分p38MAPK/STAT3信号通路在E2调节INS-1细胞功能中的作用1.与对照组相比,E2增加INS-1细胞中GPER、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-STAT3/STAT3、TOM20、Hsp60蛋白表达以及降低LC3-Ⅱ蛋白表达;增加p62、TOM20、Hsp60 m RNA表达。2.与对照组相比,G15降低INS-1细胞中GPER、p-p38MAPK/p38MAPK、p-STAT3/STAT3、TOM20、Hsp60蛋白表达以及增加LC3-Ⅱ蛋白表达;降低p62、TOM20、Hsp60 m RNA表达。3.与对照组相比,SB203580降低INS-1细胞中p-p38MAPK/p38 MAPK、p-STAT3/STAT3、TOM20、Hsp60蛋白表达以及增加LC3-Ⅱ蛋白表达;降低p62、TOM20、Hsp60 m RNA表达。4.与对照组相比,Stattic降低INS-1细胞中p-STAT3/STAT3、TOM20、Hsp60蛋白表达以及增加LC3-Ⅱ蛋白表达;降低p62、TOM20、Hsp60 m RNA表达。5.与对照组相比,E2增加INS-1细胞中葡萄糖摄取率及胰岛素分泌水平;G15、SB203580、Stattic均降低葡萄糖摄取率及胰岛素分泌水平。结论:1.SD大鼠胰腺组织及INS-1细胞中存在GPER,E2可以上调GPER活性。2.E2可改善大鼠胰腺组织胰岛素抵抗及INS-1细胞葡萄糖摄取、胰岛素分泌。3.线粒体自噬参与E2调节INS-1细胞葡萄糖摄取及胰岛素分泌。4.p38MAPK/STAT3信号通路参与了E2对INS-1细胞线粒体自噬,葡萄糖摄取及胰岛素分泌的调节。