论文部分内容阅读
酮病是过渡期高产奶牛常见的营养代谢病之一,往往造成奶牛乳腺组织炎性损伤导致产奶量减少和乳品质下降,给奶牛养殖业造成重大经济损失。酮病奶牛存在严重的代谢应激,致使乳腺上皮细胞线粒体损伤,进而产生过量线粒体活性氧（Mito-ROS）,激活NOD样受体蛋白3（NLRP3）介导的炎性反应,导致乳腺组织炎性损伤。PTEN介导的假定激酶1（PINK1）是一种监测线粒体状态的蛋白激酶,其介导的线粒体自噬通过降解受损的线粒体来控制线粒体的质量和Mito-ROS的产生,进而维持线粒体稳态。线粒体自噬与炎症反应呈负调控关系,但线粒体自噬在酮病奶牛乳腺组织炎性损伤中的作用机制尚不明确。因此,本研究旨在明确PINK1介导的线粒体自噬对酮病奶牛乳腺组织炎性损伤的调节机制。通过采集健康奶牛,亚临床（SCK）和临床型（CK）酮病奶牛的乳腺组织样品检测乳腺组织中NLRP3炎性信号通路,线粒体功能和线粒体自噬相关蛋白的表达变化。结果发现,SCK和CK奶牛血清中非酯化脂肪酸（NEFA）和β-羟丁酸（BHBA）浓度显著高于健康奶牛,而葡萄糖（GLU）浓度显著低于健康奶牛,说明酮病奶牛存在严重的代谢应激。与健康奶牛相比,SCK和CK奶牛乳腺组织中NLRP3炎性信号通路相关分子:NLRP3、活化型半胱天冬蛋白酶-1（CleavedCaspase-1）的蛋白表达显著上升;促炎因子白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的蛋白和m RNA表达水平均显著升高,说明SCK和CK奶牛乳腺组织中存在炎性反应且NLRP3炎性小体过度激活。与健康奶牛相比,SCK和CK奶牛乳腺组织中线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）复合物:COⅠ、COⅡ、COⅢ、COⅣ和COⅤ的蛋白表达在SCK奶牛乳腺组织中均显著上升,说明SCK奶牛乳腺组织的线粒体功能增强;而在CK奶牛乳腺组织中COⅠ、COⅡ、COⅢ、COⅣ和COⅤ的蛋白表达均显著下降,说明CK奶牛乳腺组织存在线粒体功能障碍。与健康奶牛相比,SCK和CK奶牛乳腺组织中线粒体自噬相关分子:PINK1、Parkin和LC3-Ⅱ的蛋白表达显著上升,而P62的蛋白表达显著下降,说明酮病奶牛乳腺组织中线粒体自噬被激活。通过体外培养奶牛乳腺上皮细胞系MAC-T,使用1μg/m L的脂多糖（LPS）刺激MAC-T细胞构建乳腺上皮细胞炎症模型进行研究。结果显示,在LPS处理0 h、3 h、6 h、9 h和12 h后,MAC-T细胞中线粒体OXPHOS复合物COⅠ、COⅡ、COⅢ、COⅣ和COⅤ的蛋白表达水平在6 h、9 h和12 h组中显著下降。LPS处理9 h后Mito-ROS的产生增加。LPS处理后,在6 h、9 h和12 h组中,NLRP3炎性信号通路相关分子:NLRP3、Caspase-1的蛋白表达显著上升;促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白和m RNA表达水平显著上升。LPS处理9 h后NLRP3的免疫荧光强度显著增加。在LPS处理0 h、3 h、6 h、9 h和12 h后,线粒体自噬相关分子:PINK1、Parkin和LC3-Ⅱ的蛋白表达显著上升,而P62的蛋白表达显著下降。LPS处理9 h后PINK1/Parkin与线粒体外膜转位酶20（TOMM20）共定位的荧光强度增加。转染重组腺病毒MRFP-GFP-LC3 48 h且添加LPS处理9 h后自噬小体（黄色斑点）和自噬溶酶体（红色斑点）数量增多。以上表明,LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞线粒体功能障碍,进而导致炎症反应,并激活了线粒体自噬。为了研究PINK1介导的线粒体自噬对奶牛乳腺上皮细胞炎性反应的调控机制。本研究在MAC-T细胞中转染PINK1干扰RNA或添加自噬抑制剂3-MA,结果发现,沉默PINK1或者添加3-MA通过降低PINK1、Parkin和LC3-Ⅱ的蛋白表达,增加P62的蛋白表达以及减少自噬小体和自噬溶酶体数量,进而抑制LPS诱导的线粒体自噬;通过降低COⅠ、COⅡ、COⅢ、COⅣ和COⅤ的蛋白表达和增加Mito-ROS产生,加剧了LPS诱导的线粒体功能障碍;通过增加NLRP3、Caspase-1的蛋白表达和增加促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白和m RNA表达水平,加剧了LPS诱导的炎性反应。转染PINK1过表达腺病毒后,结果显示,过表达PINK1通过增加PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ和减少P62的蛋白表达进而增强LPS诱导的线粒体自噬。此外,过表达PINK1通过增加COⅠ、COⅡ、COⅢ、COⅣ和COⅤ的表达和减少Mito-ROS的产生,缓解了LPS诱导的线粒体功能障碍;通过降低NLRP3和Caspase-1的蛋白表达和促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白和m RNA表达水平,减轻了LPS诱导的炎性反应。这些结果证实,在奶牛乳腺上皮细胞中PINK1通过参与调控线粒体自噬进而缓解LPS诱导的线粒体功能障碍和炎性反应。综上所述,酮病奶牛乳腺上皮细胞发生线粒体功能障碍,激活NLRP3炎性信号通路引发炎症反应,而PINK1介导的线粒体自噬在其中起负调控作用。