背景:医院内获得性感染(HAI)已成为人类健康最大威胁之一,而铜绿假单胞菌(Pseudomonas areuginas,PA)是则HAI致病菌中重要的一种。该菌为革兰阴性杆状条件致病菌,患者抵抗力低下或有侵入性操作可导致感染概率明显增加。PA也是呼吸科、重症监护病房(ICU)感染的重要病原菌,随着广谱抗菌药物、免疫抑制剂、肿瘤化疗药物等的普遍使用,加之该菌易定植、易变异、耐药机制复杂,其耐药性及多重耐药性显著增强,已成为临床治疗亟待解决的难题。目前PA对常用抗菌药物耐药率逐渐升高,所以深入研究PA的致病和耐药机制、合理使用抗生素以及开发新型抗菌药物对有效治疗PA感染、改善患者预后、降低病死率至关重要。目前关于治疗PA感染,最主要的方法仍然是使用抗生素等抗菌药物,临床上治疗PA感染的抗菌药物主要包括β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、多粘菌素类药物等。环丙沙星是目前抗假单胞菌活性最强的喹诺酮类药物,但随着其在临床上的广泛应用,PA对环丙沙星的耐药性也逐年增强,所以寻找新型抗菌药物已是当务之急。亚油酸是人体必需脂肪酸,脂肪酸作为活性物质和药物载体已应用于制药行业。ω-3脂肪酸在治疗糖尿病、抗癌、抗炎以及免疫调节活动中的作用使人们开始研究其对微生物活动的影响。在细菌中,游离脂肪酸通过多种方式作用于细菌细胞膜,使细菌繁殖受阻或引起细胞凋亡样的杀菌效应。但将亚油酸应用于抗菌治疗方面的研究报道还较少。SOS反应也称应急反应,指DNA受到严重损伤时,多种基因诱导的DNA修复以维持DNA的完整性。SOS反应由激活蛋白RecA和阻遏蛋白LexA等相互调控。DNA受到损伤后与RecA结合,结合后促使LexA发生自我切割,于是SOS修复酶类相继合成。SOS反应则与铜绿假单胞菌生物膜、绿脓菌素产生等有关。群体感应(Quorum-sensing,QS)系统是指当环境中的微生物种群密度达到阈值时,相关信号分子也达到一定水平,通过一些相关蛋白比如受体蛋白的信号传递,诱导或者阻止信号最终传递到细胞内,影响细菌特定基因的表达,调控微生物群体的生理特征,如生物发光、抗生素合成,生物膜形成等以适应环境变化。通过QS机制进行“细胞对细胞”的交流,细菌能够在恶劣的环境中协调一致,以“团队作战能力”使整个种群更好地存活下来。QS系统主要包括lasI-lasR信号系统和rhlI-rhlR信号系统。当环境中存在抗菌剂等不利因素时,铜绿假单胞菌的QS系统会介导自身产生外毒素A和弹性蛋白酶等,增强自身致病性。目的:通过抑菌实验证实亚油酸的抑菌作用。qRT-PCR检测SOS反应相关基因RecA在mRNA水平上的表达,分析作为不同类型的抗菌剂,亚抑菌浓度的环丙沙星和亚油酸在不同时间点诱发铜绿假单胞菌产生SOS反应的情况,再通过qRT-PCR检测QS系统相关基因(lasI、lasR、rhlI、rhlR)的表达,分析在SOS反应条件下,铜绿假单胞菌QS系统和致病能力的变化,以期深入了解铜绿假单胞菌致病机制以及认识到药物剂量不足给临床治疗带来的危害,协助抗菌药物研发和指导临床合理用药。方法:1.从临床病人体内分离、培养铜绿假单胞菌,以铜绿假单胞菌ATCC 27853为质控菌株,双重PCR法鉴定该菌株。2.培养基稀释法和肉眼观察法测定环丙沙星和亚油酸对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(MIC),并进一步分别测定了阴性对照组、3/4 MIC、2/4 MIC、1/4 MIC环丙沙星/亚油酸组的细菌生长状况。3.qRT-PCR分析亚抑菌浓度的环丙沙星和亚油酸在不同时间点(4 h和24 h)对铜绿假单胞菌SOS反应的影响。4.qRT-PCR分析SOS反应条件下铜绿假单胞菌QS系统的变化情况。5.检测SOS反应条件下,铜绿假单胞菌生物膜、绿脓菌素和胞外DNA的表达情况,分析其致病能力的变化。结果:1.培养基稀释法和肉眼观察法确定环丙沙星MIC为2μg/ml,亚油酸MIC为1.5 mg/ml,且生长曲线图表明最低抑菌浓度下细菌生长受到明显抑制。2.qRT-PCR结果显示,在4 h时间点,亚抑菌浓度的环丙沙星和亚油酸均使RecA上调,且环丙沙星组RecA表达量高于亚油酸组;在24 h时间点,亚抑菌浓度的环丙沙星和亚油酸均使RecA下调。3.qRT-PCR结果显示,在4 h时间点,亚抑菌浓度的环丙沙星和亚油酸均使lasI、lasR、rhlI、rhlR基因上调,且环丙沙星组lasI、lasR、rhlI、rhlR表达量高于亚油酸组;在24 h时间点,亚抑菌浓度的环丙沙星和亚油酸均使lasI、lasR、rhlI、rhlR基因下调。4.检测生物膜、绿脓菌素和eDNA表达量,结果显示,亚抑菌浓度的环丙沙星和亚油酸均使其表达量增加,且环丙沙星组表达量高于亚油酸组。结论:1.低于MIC剂量的环丙沙星和亚油酸在短时间内会引起铜绿假单胞菌的SOS反应,随着时间的增长,细菌逐渐适应这种不利环境并启动一系列保护机制,所以在24 h时间点,SOS反应下降。2.qRT-PCR结果显示,低于MIC剂量的环丙沙星和亚油酸对铜绿假单胞菌SOS反应和QS系统的调节是一致的。SOS反应被激活时,QS系统表达增强;SOS反应被抑制时,QS系统表达也下降。即SOS反应条件下,QS系统活性增强。此外,较环丙沙星,低于MIC剂量的亚油酸能引起铜绿假单胞菌较低的SOS反应和QS系统表达。3.SOS反应条件下,铜绿假单胞菌致病性增强,而亚油酸能引起相对较低的致病性。侧面反映临床给药剂量不足可能会引起病原菌致病性增强,不利于根治细菌感染。4.不饱和脂肪酸---亚油酸具有抑菌效果,有望开发成为一种新型的抗菌药物或辅助抗菌药物。