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背景:ε-毒素(ε-toxin,ETX)是由产气荚膜梭菌B型和D型菌株产生的一种气单胞菌溶素(Aerolysin)类孔道形成毒素。它可以导致人多发性硬化症、人红细胞溶血、致命性肠毒血症(山羊和绵羊)、羊的髓性肾脏病等多种疾病。大规模基因组测序发现ETX结构域存在于从细菌到脊椎动物的多个物种中,其中βγ-CAT是实验室前期从两栖动物皮肤分泌物中分离纯化到的一种气单胞菌溶素类似蛋白(Aerolysin-like protein,ALP)和三叶因子(Trefoil factor,TFF)复合物,它参与调节宿主抗感染免疫(Xiang et al.,PNAS,2014)及伤口修复(Gao et al.,FASEB Journal,2018)等生理病理功能。然而在哺乳动物基因组中无编码ETX的基因,但产气荚膜梭菌是哺乳动物正常肠道菌群的一部分,正常人群中也有部分人被检出ETX抗体。感染性的产气荚膜梭菌主要经口感染胃肠道。在哺乳动物(如:人、大鼠、小鼠)胃肠道中,存在编码三个TFF蛋白(TFF1, TFF2,TFF3)的基因,其主要由胃肠道上皮细胞分泌。哺乳动物肠道菌群产生的ETX和宿主TFF组织分布的相似性及βγ-CAT的结构特征,使我们推测:ETX和TFF在生物化学水平和生物学功能水平上是否会发生相互作用?
方法:(1)生物信息学分析:在NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)通过保守性结构域搜索工具寻找ETX保守结构域类似蛋白;通过ZDOCK(http://zdock.umassmed.edu/)对ETX和TFF进行分子对接,用Pymol2.7对其可能的结合位点进行分析和展示。
(2)蛋白质表达与纯化:通过培养产气荚膜梭菌C58-1菌株获得ETX前体蛋白(proETX,在本文简称为rETX);通过大肠杆菌原核表达获得重组ETX(rETX,在本文中简称为rETX)、重组TFF2、重组TFF3(rhTFF2和rhTFF3,在本文中简称为rhTFF2和rhTFF3)和Trx蛋白(在本文中简称为Trx)。
(3)蛋白质活性检测:使用MTS法和LDH释放法进行细胞毒性检测。
(4)细胞水平检测TFF对ETX的生物学活性影响:使用MTS法、人红细胞溶血及免疫荧光法。
(5)生物化学水平检测ETX与TFF的相互作用:通过斑点杂交的方法检测两种蛋白之间的相互作用。
结果:(1)生物信息学分析结果如下:ETX类似结构域在自然界中广泛存在于细菌、真菌、植物、无脊椎动物及脊椎动物中(如Aerolysin、Eubacterium、Pore-formingtoxin-likeproteinHfr-2、LOC100145764protein、Aerolysin-likeproteinBacteria等)。通过ZDOCK预测TFF2和ETX可能的结合氨基酸残基为Tyr(Y)43、Asn(N)45、Tyr(Y)49、Asp(D)51、Asn(N)154,而TFF3和ETX可能的结合氨基酸残基为Tyr(Y)35、Asn(N)45、Tyr(Y)49、Asp(D)51、Ala(A)211。预测的结合位点中的氨基酸残基在不同物种中的保守性有一定的差异,其共同的关键氨基酸残基为:Asn(N)45、Tyr(Y)49、Asp(D)51。
(2)蛋白表达与纯化结果如下:从产气荚膜梭菌中分离出proETX蛋白,银染检测证明其含量约为10%。通过密码子优化,将ETX、TFF2和TFF3编码序列克隆至pET32a(+)载体,并使用大肠杆菌BL21(DE3)PLySs菌株表达纯化得到rETX、rhTFF2和rhTFF3蛋白。用pET32a(+)载体在大肠杆菌BL21(DE3)PLySs中表达纯化得到Trx蛋白。SDS-PAGE初步检测蛋白质纯度均在80%以上。
(3)蛋白活性检测结果如下:以MDCK细胞为模型检测proETX、胰酶活化的proETX和重组rETX对细胞的毒性作用。MTS和LDH释放法检测发现proETX对MDCK细胞的半数毒性浓度(CC50)分别为:0.4~0.8μmol/L之间(MTS)和0.58μmol/L(LDH);胰酶活化后的proETX对MDCK细胞的半数毒性浓度(CC50)分别为0.48μmol/L(MTS)和0.91μmol/L(LDH);rETX对MDCK细胞的半数毒性浓度(CC50)分别为10~20nmol/L(MTS)和17.14nmol/L(LDH)。以上结果均说明蛋白具有活性。
(4)细胞水平检测TFF对ETX的生物学活性影响结果如下:采用直接混合、体外预混的方式,发现rhTFF2和rhTFF3均可以促进ETX对MDCK细胞的毒性,但标签蛋白Trx并不能促进ETX的毒性。非常值得注意的是:MDCK细胞被其它蛋白分别预处理3h后再加入rETX时,rhTFF2、rhTFF3和Trx对rETX的毒性没有影响。这说明rhTFF2、rhTFF3和rETX在细胞上的结合位点可能相同或者位置相近。rhTFF2、rhTFF3和Trx对rETX引起的人红细胞溶血无影响。这说明其相互作用可能具有细胞特异性。免疫荧光结果发现:rhTFF2和rhTFF3与rETX在MDCK细胞上可以发生共定位。
(5)斑点杂交的方法检测发现rhTFF2蛋白和rhTFF3蛋白都与rETX无明显的强结合作用。这表明rhTFF2和rhTFF3蛋白与rETX蛋白的相互作用可能还需要其它辅助因子的参与。
讨论:本研究基于实验室前期发现的两栖动物来源的气单胞菌溶素类似蛋白(Aerolysin-like protein,ALP)和三叶因子(Trefoil factor,TFF)的可能相互作用,通过生物信息学进行蛋白质分子对接,发现哺乳动物肠道产气荚膜梭菌来源的ETX可以和胃肠道三叶因子TFF2及TFF3相互结合。为了检测其功能相互作用,建立了ETX和TFF蛋白的高效表达方法,明确了TFF对ETX引起的细胞毒性的促进作用,说明类似βγ-CAT的存在方式可能是三叶因子和孔道形成毒素的一类保守的作用方式。但是斑点杂交并未检测到TFF和ETX的结合,这可能是因为二者的结合力较弱,需要更加灵敏的方法进行检测;或者二者结合需要细胞膜表面的脂类或者辅助受体参与。本研究的意义在于明确了宿主蛋白TFF对毒素蛋白ETX功能的调节作用,发现了哺乳动物宿主蛋白与毒素的类似作用和复合物的存在;发现了潜在的干预ETX毒性的新靶点。
结论:βγ-CAT类似的作用方式,即气单胞菌溶素类似蛋白和三叶因子蛋白的协同作用,可能也存在于哺乳动物宿主蛋白和细菌孔道形成毒素之间,但其作用机制有待进一步研究。
方法:(1)生物信息学分析:在NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)通过保守性结构域搜索工具寻找ETX保守结构域类似蛋白;通过ZDOCK(http://zdock.umassmed.edu/)对ETX和TFF进行分子对接,用Pymol2.7对其可能的结合位点进行分析和展示。
(2)蛋白质表达与纯化:通过培养产气荚膜梭菌C58-1菌株获得ETX前体蛋白(proETX,在本文简称为rETX);通过大肠杆菌原核表达获得重组ETX(rETX,在本文中简称为rETX)、重组TFF2、重组TFF3(rhTFF2和rhTFF3,在本文中简称为rhTFF2和rhTFF3)和Trx蛋白(在本文中简称为Trx)。
(3)蛋白质活性检测:使用MTS法和LDH释放法进行细胞毒性检测。
(4)细胞水平检测TFF对ETX的生物学活性影响:使用MTS法、人红细胞溶血及免疫荧光法。
(5)生物化学水平检测ETX与TFF的相互作用:通过斑点杂交的方法检测两种蛋白之间的相互作用。
结果:(1)生物信息学分析结果如下:ETX类似结构域在自然界中广泛存在于细菌、真菌、植物、无脊椎动物及脊椎动物中(如Aerolysin、Eubacterium、Pore-formingtoxin-likeproteinHfr-2、LOC100145764protein、Aerolysin-likeproteinBacteria等)。通过ZDOCK预测TFF2和ETX可能的结合氨基酸残基为Tyr(Y)43、Asn(N)45、Tyr(Y)49、Asp(D)51、Asn(N)154,而TFF3和ETX可能的结合氨基酸残基为Tyr(Y)35、Asn(N)45、Tyr(Y)49、Asp(D)51、Ala(A)211。预测的结合位点中的氨基酸残基在不同物种中的保守性有一定的差异,其共同的关键氨基酸残基为:Asn(N)45、Tyr(Y)49、Asp(D)51。
(2)蛋白表达与纯化结果如下:从产气荚膜梭菌中分离出proETX蛋白,银染检测证明其含量约为10%。通过密码子优化,将ETX、TFF2和TFF3编码序列克隆至pET32a(+)载体,并使用大肠杆菌BL21(DE3)PLySs菌株表达纯化得到rETX、rhTFF2和rhTFF3蛋白。用pET32a(+)载体在大肠杆菌BL21(DE3)PLySs中表达纯化得到Trx蛋白。SDS-PAGE初步检测蛋白质纯度均在80%以上。
(3)蛋白活性检测结果如下:以MDCK细胞为模型检测proETX、胰酶活化的proETX和重组rETX对细胞的毒性作用。MTS和LDH释放法检测发现proETX对MDCK细胞的半数毒性浓度(CC50)分别为:0.4~0.8μmol/L之间(MTS)和0.58μmol/L(LDH);胰酶活化后的proETX对MDCK细胞的半数毒性浓度(CC50)分别为0.48μmol/L(MTS)和0.91μmol/L(LDH);rETX对MDCK细胞的半数毒性浓度(CC50)分别为10~20nmol/L(MTS)和17.14nmol/L(LDH)。以上结果均说明蛋白具有活性。
(4)细胞水平检测TFF对ETX的生物学活性影响结果如下:采用直接混合、体外预混的方式,发现rhTFF2和rhTFF3均可以促进ETX对MDCK细胞的毒性,但标签蛋白Trx并不能促进ETX的毒性。非常值得注意的是:MDCK细胞被其它蛋白分别预处理3h后再加入rETX时,rhTFF2、rhTFF3和Trx对rETX的毒性没有影响。这说明rhTFF2、rhTFF3和rETX在细胞上的结合位点可能相同或者位置相近。rhTFF2、rhTFF3和Trx对rETX引起的人红细胞溶血无影响。这说明其相互作用可能具有细胞特异性。免疫荧光结果发现:rhTFF2和rhTFF3与rETX在MDCK细胞上可以发生共定位。
(5)斑点杂交的方法检测发现rhTFF2蛋白和rhTFF3蛋白都与rETX无明显的强结合作用。这表明rhTFF2和rhTFF3蛋白与rETX蛋白的相互作用可能还需要其它辅助因子的参与。
讨论:本研究基于实验室前期发现的两栖动物来源的气单胞菌溶素类似蛋白(Aerolysin-like protein,ALP)和三叶因子(Trefoil factor,TFF)的可能相互作用,通过生物信息学进行蛋白质分子对接,发现哺乳动物肠道产气荚膜梭菌来源的ETX可以和胃肠道三叶因子TFF2及TFF3相互结合。为了检测其功能相互作用,建立了ETX和TFF蛋白的高效表达方法,明确了TFF对ETX引起的细胞毒性的促进作用,说明类似βγ-CAT的存在方式可能是三叶因子和孔道形成毒素的一类保守的作用方式。但是斑点杂交并未检测到TFF和ETX的结合,这可能是因为二者的结合力较弱,需要更加灵敏的方法进行检测;或者二者结合需要细胞膜表面的脂类或者辅助受体参与。本研究的意义在于明确了宿主蛋白TFF对毒素蛋白ETX功能的调节作用,发现了哺乳动物宿主蛋白与毒素的类似作用和复合物的存在;发现了潜在的干预ETX毒性的新靶点。
结论:βγ-CAT类似的作用方式,即气单胞菌溶素类似蛋白和三叶因子蛋白的协同作用,可能也存在于哺乳动物宿主蛋白和细菌孔道形成毒素之间,但其作用机制有待进一步研究。