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背景:伏格特-小柳-原田（Vogt-Koyanagi-Harada,VKH）综合征是一种严重威胁青壮年视力的自身免疫性葡萄膜炎,同时伴有内耳、神经系统以及皮肤等多组织多器官损伤的症状。经过几十年的研究,对VKH综合征的发病机理已有初步认识。基于VKH综合征患者的淋巴细胞在黑色素细胞提取物的刺激下发生增殖反应,且该淋巴细胞在体外对黑色素细胞具有细胞毒性,目前认为VKH综合征的发生与机体针对黑色素细胞的自身免疫应答相关。小鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎（Experimental autoimmune uveitis,EAU）模型是人类VKH综合征的经典动物模型,借助该模型,已发现Th1细胞和Th17细胞为主要致病细胞。对VKH综合征患者眼部病变组织进行免疫组化染色,发现脉络膜炎症组织中浸润的主要细胞类型为淋巴细胞,其中约70%为T淋巴细胞,且脉络膜黑色素细胞表达HLA-DR分子,提示CD4+T细胞介导的免疫应答在VKH综合征的发病过程中可能发挥重要作用。除T细胞外,其他免疫细胞在VKH综合征中的作用亦有报道,包括NK细胞,B细胞及髓系来源细胞。总之,多种免疫细胞可参与VKH综合征的发生发展,但这些细胞通常具有高度异质性,其功能随所属亚群、分化阶段以及极化状态而变化。目前尚缺乏对这些细胞或其功能亚群参与VKH综合征的系统性研究。由于从病变眼部组织收集样本（例如房水或脉络膜）操作难度较大,目前对病患眼部确切的免疫反应所知甚少。因此,针对VKH综合征患者外周血免疫细胞的研究即成为一种必要的辅助手段,可为阐明该疾病的发病机制提供线索。VKH综合征的临床治疗以糖皮质激素（Glucocorticoid,GC）为主,辅以免疫抑制剂和生物制剂。GC治疗的临床疗效较佳,且多数患者对此响应,但其作用于免疫细胞发挥治疗效应的具体机制尚待阐明。另外GC亦存在副作用较多、治疗时间较长及病人依从性差等诸多不足。因此,确定VKH综合征患者外周血免疫细胞表型特征以及激素治疗对该表型的影响,将有助于阐明VKH综合征发病的免疫学机制,并为未来发现VKH疾病治疗的新靶点提供线索。目的:本课题旨在通过比较VKH综合征患者与健康对照、患者在激素治疗前/后的外周血免疫学表型,并对外周血进行转录组学分析,探究在VKH综合征发生、发展和激素治疗过程中发挥重要作用的免疫细胞和免疫分子,藉此寻找治疗VKH综合征的新靶点。方法:收集VKH综合征患者激素治疗前（Before）外周血样本25例,连续七天甲强龙（MP,VKH综合征治疗中使用最广泛的糖皮质激素）治疗后（After）VKH综合征患者的外周血样本16例,性别和年龄相匹配的健康对照（HC）外周血样本21例。借助流式细胞术、细胞因子胞内染色法检测外周血中白细胞以及其亚群的分布和表型;Luminex和ELISA检测血浆中细胞因子的含量;对外周血进行RNA测序并进行转录组学分析,找到可能的基因靶点,并通过qPCR和体外PBMC培养实验对测序结果进行验证;最后,对VKH患者外周血CD56+单核细胞亚群（其数量明显高于健康对照组,可能参与VKH综合征发病）进行研究,借助激光共聚焦显微镜进行形态学鉴别,并进行体外实验初步研究其功能（产生ROS的能力）。结果:1.与健康对照组相比,VKH综合征患者外周血中的免疫细胞组成存在差异,表现为:①T细胞数量明显增多,尤其是活化的T细胞（NKG2D+/HLA-DR+）,且主要为效应细胞亚群（IFN-γ+Tc）以及可快速分化为效应细胞的记忆细胞亚群（TEM和TEMRA）;②未类别转换记忆B细胞（CD27+IgD+B细胞）数量明显增多;③单核细胞数量明显增多,包括经典型单核细胞（CD14++CD16-）、非经典型单核细胞（CD14+CD16++）以及CD56+单核细胞。2.VKH综合征患者激素治疗后与治疗前相比,其外周血:①T细胞和NK细胞比例下降,尤其是活化NK细胞（NKG2D+NK）比例下降,CD8+T细胞TCM/TEM比值升高;②经典型单核细胞及CD56+单核细胞数量增多,而中间型单核细胞（CD14++CD16+）的比例以及非经典型单核细胞的比例和数量均降低。3.外周血转录组学分析发现:相比健康对照,VKH综合征患者外周血凋亡相关基因下调,炎症相关基因上调;相比激素治疗前,激素治疗后外周血中与淋巴细胞活化、增殖和分化相关的基因上调,与凋亡相关的基因上调;对上述两两比较所得到的差异表达基因进行综合分析,寻找差异表达趋势相反的基因交集（这些基因的表达产物可能是VKH致病以及激素治疗的靶分子）,我们发现了其中代表性基因NOS3并进行表达验证。4.体内外实验验证RNA测序中的发现,即“激素治疗可诱导免疫细胞凋亡”:VKH综合征患者经激素治疗后外周血免疫细胞的凋亡比例增加;激素体外刺激健康人和VKH综合征患者来源的PBMC,亦发现细胞凋亡比例增多。5.借助激光共聚焦显微镜对CD56+单核细胞亚群进行鉴定,确定了 CD56+单核细胞乃一群既表达CD14又表达CD56的单核细胞亚群;且与CD56-单核细胞相比,CD56+单核细胞产生ROS的能力更强。结论:我们的研究结果表明,VKH综合征患者外周血免疫细胞分布及功能失衡是其主要免疫学特征,表现为T细胞过度活化及单核细胞增多。激素治疗可通过直接抑制T细胞活化、诱导免疫细胞凋亡以及影响单核细胞亚群分布发挥其治疗效应。