猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是一种高度传染性的猪病,主要引起仔猪急性腹泻、呕吐、肠炎等临床症状。该病发病率和死亡率高,新生仔猪尤为易感,是全球养猪业面临的主要威胁因素之一。反向遗传操作系统是冠状病毒的病毒学研究和疫苗开发的重要工具。由于冠状病毒的基因组较大并且在大肠杆菌中存在不稳定的问题,因此冠状病毒感染性cDNA克隆的构建和操作依旧费时费力。本研究的目的旨在建立基于酵母转化重组的反向遗传操作系统,运用CRISPR/Cas9基因编辑技术与同源重组技术快速构建表达报告基因的报告病毒及初步建立PEDV的抗病毒药物筛选平台。首先,为了克服冠状病毒基因组太大、某些复制酶基因存在毒性而在大肠杆菌中复制不稳定等因素,本研究运用酵母转化相关重组技术（transformation-associated recombination,TAR）构建了基因Ⅱ型PEDV毒株HM的全长cDNA克隆。拯救出的病毒（rPEDV）在体外表现出与野生型病毒相似的生长特性。利用该PEDV感染性cDNA克隆与CRISPR/Cas9技术及同源重组结合,构建出报告病毒rPEDV-EGFP,其中该病毒的ORF3基因被替换成EGFP基因。该报告病毒表现出与亲本病毒rPEDV相似的生长特性,并且在体外连续传代过程中保持稳定。该PEDV感染性cDNA克隆的构建和操作策略极其简单和高效,亦可应用于其他RNA病毒和DNA病毒。其次,报告病毒对研究抗病毒药物的筛选具有重要价值。由于报告病毒rPEDV-EGFP在ORF3基因位置表达的报告基因水平低,阻碍了其在抗病毒药物筛选中的应用。本研究运用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组将EGFP基因与病毒核衣壳蛋白（N）编码基因融合表达,并且在两者中引入明脉扁刺蛾病毒（Thosea asigna virus）的2A多肽编码序列,成功构建了报告病毒rPEDV-EGFPN。亚基因组RNA序列测定结果表明,EGFP和N由一个亚基因组RNA翻译出来。另外,免疫印迹试验未能检测到EGFP和N的融合蛋白,说明T2A引起核糖体跳跃（Ribosome Skipping）将EGFP和N蛋白分开。该报告病毒表现出与亲本病毒rPEDV相似的生长特性,并且在连续传代中具有良好的遗传稳定性。与rPEDV-EGFP相比,该报告病毒表达更高水平的EGFP,表明EGFP绿色荧光信号可以用于监测报告病毒的感染情况。基于此,我们将该报告病毒应用于建立PEDV抗病毒药物筛选平台。应用该报告病毒我们开发了针对PEDV的抗病毒药物筛选平台,并验证了已报道的药物GC376和Melatonin抑制PEDV复制的抗病毒作用。我们通过该系统证实了 Allicin在PEDV感染细胞中的抗病毒作用。总之,本研究运用酵母转化重组技术建立基因Ⅱ型PEDV变异毒株的反向遗传操作系统。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,我们提供了两种策略来构建PEDV报告病毒。此外,还利用报告病毒建立了针对PEDV的抗病毒药物筛选试验,并证实了 Allicin对PEDV的抑制作用。