研究背景及目的:老化导致的心血管系统结构和功能改变,是高血压、动脉粥样硬化等疾病发生发展病理生理学基础之一。血管老化突出表现为修复、新生能力降低,血管壁出现增厚、钙化,血管弹性及顺应性下降。弹性动脉这些变化,主要与血管平滑肌细胞（VSMC）衰老发生功能失调有关。当VSMC发生衰老时,可出现成骨样分化,细胞由张力型转变为分泌型,分泌多种炎性因子,诱发持久的氧化应激和炎性损伤,进一步破坏细胞外基质,导致血管的重构。因此,VSMC衰老被认为是血管老化的主要病理机制之一。虽然年龄增长不可避免,但通过干预老化或衰老进程中的一些重要调控靶点,或可延缓血管老化的进程,改善与之相关的病理生理学变化。近年来大量研究显示,肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子（tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis,TWEAK）与一些心血管疾病如高血压、动脉粥样硬化、肺动脉高压、心肌病等密切相关。TWEAK广泛表达于人体多种正常细胞和组织中,如血管壁细胞、心肌细胞、关节结缔组织、肺脏、肾脏和一些肿瘤细胞等,是肿瘤样坏死因子（TNF）超家族的成员之一,并具有TNF家族其他成员一些类似作用。TWEAK与其主要特异性受体成纤维细胞生长因子诱导蛋白14（fibroblast growth factor inducible 14,Fn14）结合,可以激活包括核转录因子κB（NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT）在内的多条主要信号转导通路,触发炎症及氧化应激反应,参与调节细胞迁移、分化、增殖、凋亡、钙化等,而这些也是心血管重构中的一些基本病理机制。近期有实验证实,TWEAK可通过NF-κB活化途径促进无机磷酸盐诱导的血管平滑肌成骨样转化;在老年小鼠骨骼肌中Fn14表达明显增多,TWEAK/Fn14可以促进年龄相关的骨骼肌萎缩与纤维化。TWEAK还可以通过降低一氧化氮合酶（NOS）活性及NO含量、上调单核细胞血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1（LOX-1）、诱导炎性细胞分泌炎性因子及黏附分子等机制促进血管炎性反应、降低血管舒缩功能、诱导血管细胞凋亡。但TWEAK/Fn14信号轴是否影响VSMC衰老并参与血管老化进程,目前尚不明确。为此,本研究将以大鼠主动脉VSMC为研究对象,观察TWEAK、Fn14在VSMC衰老时表达情况,分析TWEAK/Fn14信号轴对VSMC衰老的影响及作用,探讨其中涉及的可能机制。阐明上述问题,将有可能为进一步研究血管老化机制提供新的研究靶点,以期从病因学角度为衰老相关心血管疾病预防、诊治、评估提供新的生物学证据。研究方法:第一部分观察TWEAK及Fn14在AngⅡ诱导大鼠主动脉VSMC衰老时的表达情况,实验分为2组:对照组、AngⅡ组;利用腺病毒过表达TWEAK,研究TWEAK/Fn14信号轴在VSMC衰老进展中的作用,实验分为4组:对照组、未感染组、Ad-NC组、Ad-TWEAK组。1.构建大鼠主动脉VSMC应激衰老模型:用含10%胎牛血清的培养基培养细胞生长至30%-50%汇合后,无血清培养24小时使细胞同步化,换用含1%胎牛血清的培养基,加入AngⅡ(1×10-7mol/L)至AngⅡ组分别处理1、3、7天,对照组正常培养。2.检测衰老相关标志物及TWEAK、Fn14表达情况:应用细胞衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色及Western Blot检测P53、P21蛋白表达,来评估各组细胞衰老情况;Western Blot检测TWEAK、Fn14蛋白在VSMC表达情况。3.构建TWEAK过表达腺病毒并转染VSMC:设计并制成TWEAK过表达腺病毒及其对照载体（绿色荧光标记）,选择对数生长期大鼠VSMC,进行腺病毒转染,Ad-NC组、Ad-TWEAK组分别转染空载体腺病毒及TWEAK过表达腺病毒。细胞感染腺病毒48小时后,应用荧光显微镜观察各组TWEAK过表达腺病毒感染情况,应用实时荧光定量PCR、Western Blot检测各组TWEAK m RNA及蛋白表达,评估腺病毒转染效果。4.利用AngⅡ对转染后的VSMC进行诱导衰老:细胞感染48小时后,未感染细胞组、Ad-NC组及Ad-TWEAK组VSMC分别加入AngⅡ处理1、3、7天,对照组不加AngⅡ。5.检测及分析过表达的TWEAK对VSMC应激衰老的影响:应用SA-β-Gal染色试剂盒检测不同时间点各组细胞衰老状况,Western Blot检测不同时间点各组Fn14、P53、P21蛋白表达。第二部分通过过表达TWEAK及应用P38、NF-κB磷酸化抑制剂的方式,研究P38、NF-κB通路在TWEAK参与VSMC衰老中的作用,实验分为5组:对照组、Ad-NC组、Ad-TWEAK组、Ad-TWEAK+P38抑制剂组、Ad-TWEAK+NF-κB抑制剂组;利用si RNA干扰Fn14表达,进一步明确TWEAK/Fn14信号轴对VSMC衰老及相关信号通路的影响,实验分为4组:对照组、TWEAK组、TWEAK+NC si RNA组、TWEAK+Fn14 si RNA组。1.TWEAK过表达腺病毒转染VSMC:Ad-NC组、Ad-TWEAK组分别转染空载体腺病毒及TWEAK过表达腺病毒48小时;Ad-TWEAK+P38抑制剂组、Ad-TWEAK+NF-κB抑制剂组转染TWEAK过表达腺病毒24小时之后,分别加入10μM P38抑制剂SB203580、10μM NF-κBp65抑制剂BAY11-7082处理24小时,对照组正常培养48小时。2.检测与分析在TWEAK作用下,P38、NF-κB通路活化情况以及对VSMC衰老的影响:应用Western blot检测P38、磷酸化P38、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65蛋白,评估P38、NF-κB活化水平;进行SA-β-Gal染色及Western blot检测P53蛋白评估细胞衰老情况。3.Fn14 si RNA转染VSMC:TWEAK+NC si RNA组、TWEAK+Fn14 si RNA组VSMC分别转染阴性对照si RNA及Fn14 si RNA,加重组大鼠TWEAK诱导后应用免疫荧光检测Fn14表达情况,评估si RNA转染效果。4.利用大鼠重组TWEAK对si RNA转染后的VSMC进行诱导:si RNA预处理24小时后,TWEAK组、TWEAK+NC si RNA组、TWEAK+Fn14 si RNA组VSMC分别加入TWEAK（100 ng/ml）处理48小时。5.检测及分析重组大鼠TWEAK对P38信号通路及VSMC衰老的影响:应用SA-β-Gal染色试剂盒检测SA-β-Gal活性,流式细胞仪检测细胞周期,Western Blot检测各组p-P38、P53、磷酸化P53、P21、53BP1蛋白表达。结果:1.VSMC在AngⅡ诱导下出现衰老改变。AngⅡ持续刺激1天、3天和7天后,与对照组比较,随着作用时间延长AngⅡ组VSMC中SA-β-Gal染色显著增多（P＜0.05）,P53、P21表达均显著升高（P＜0.05）。2.TWEAK、Fn14在VSMC发生应激性衰老过程中表达增多。AngⅡ持续刺激VSMC 1天、3天、7天后,AngⅡ组VSMC中TWEAK、Fn14表达较对照组均显著升高（P＜0.05）并呈时间依赖性。3.TWEAK/Fn14可促进AngⅡ诱导的VSMC衰老进程。在AngⅡ作用下,Ad-TWEAK组VSMC在过表达TWEAK时,SA-β-Gal染色较对照组、未感染组、Ad-NC组显著增多（P＜0.01）,Fn14、P53、P21在AngⅡ作用第3天、第7天时较对照组、未感染组、Ad-NC组均显著增多（P＜0.01）。4.TWEAK可活化VSMC中P38通路、NF-κB通路,促使衰老相关标志物表达增多。Ad-TWEAK组在过表达TWEAK时,p-P38及p-NF-κB p65较对照组、Ad-NC组均显著增多（P＜0.01）,与此同时,Ad-TWEAK组SA-β-Gal染色及P53表达较对照组、Ad-NC组均显著增多（P＜0.01）。5.抑制P38活化可导致TWEAK作用下VSMC衰老相关标志物表达减少。在P38磷酸化特异性抑制剂SB203580作用下,Ad-TWEAK+SB203580组p-P38表达较Ad-TWEAK组显著下降（P＜0.01）,与此相应的是Ad-TWEAK+SB203580组SA-β-Gal染色、P53表达较Ad-TWEAK组均显著降低（P＜0.01）。6.抑制NF-κB活化未显现出相应的衰老相关标志物表达显著变化。在NF-κB磷酸化特异性抑制剂BAY11-708作用下,Ad-TWEAK+BAY 11-7082组p-NF-κB p65表达较Ad-TWEAK组显著下降（P＜0.01）,但与Ad-TWEAK组相比较,Ad-TWEAK+BAY11-7082组SA-β-Gal染色、P53表达均未显示出统计学显著差异。7.进一步证实TWEAK/Fn14可通过活化P38磷酸化通路促进VSMC发生衰老改变。在si RNA干扰Fn14表达下,TWEAK+Fn14 si RNA组p-P38表达较TWEAK组显著下降（P＜0.01）,与此同时,TWEAK+Fn14 si RNA组细胞周期发生变化,SA-β-Gal染色、P53、p-P53、53BP1均较TWEAK组、TWEAK+NC si RNA组显著减少（P＜0.01）。结论:1.大鼠主动脉VSMC在AngⅡ作用下出现应激性衰老时,TWEAK、Fn14表达增多。2.TWEAK/Fn14可促进AngⅡ诱导的VSMC应激性衰老进程。3.TWEAK/Fn14促进大鼠主动脉VSMC发生衰老改变,与活化P38磷酸化通路有关。4.调控TWEAK/Fn14-P38通路可延缓大鼠主动脉VSMC发生衰老改变。