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研究背景和目的核内不均一性核糖核蛋白K(hnRNP K)是一种核酸结合蛋白,同时存在于细胞核和细胞质,它参与染色质重塑,转录,RNA选择性剪切,翻译等基因表达的过程,发挥着重要的基因表达调控作用;此外,人们发现hnRNP K与肿瘤关系密切,在多种肿瘤中呈高表达状态,他能够促进肿瘤增值和转移,甚至后病人预后相关。我们在胃癌细胞中发现hnRNP K主要分布在核内,能够调控c-myc的表达,促进癌症的发展进程;并且在胃癌细胞里hnRNP K呈现高SUMO化,低泛素化修饰状态,使其稳定性增强,发挥其促瘤增殖进程。研究方法1.应用免疫组织化学方法检测正常胃上皮组织和胃癌组织中hnRNP K的表达;应用Western blot方法检测人胃上皮细胞GES-1和胃癌细胞中hnRNP K蛋白水平。2.通过细胞免疫荧光(CIF)分别检测GES-1、BGC823、SGC7901细胞内hnRNP K的蛋白分布;运用胞核胞浆分离技术检测人正常胃上皮细胞GES-1和胃癌细胞BGC823、SGC7901中hnRNP K在胞核与胞浆内的蛋白分布差异;3.通过Western blot检测GES-1、BGC823、SGC7901细胞内c-myc的蛋白水平;通过裸鼠皮下移植瘤实验检测转染psin-vector和psin-Flag-hnRNP K质粒的BGC823细胞增殖成瘤能力4.通过Real-time PCR检测的正常胃上皮组织和胃癌组织中及细胞中hnRNP K的mRNA表达水平;利用放线菌酮(CHX)阻断蛋白翻译后检测hnRNP K的稳定性;利用MG132和CHX处理GES-1和BGC823细胞检测泛素化对于hnRNP K代谢的影响,利用MG132和CQ处理细胞检测自噬对于hnRNP K代谢的影响。5.利用免疫沉淀技术(IP)检测胃正常上皮组织和胃癌组织以及细胞中hnRNP K的ub和sumo修饰水平;利用MG132、CQ和CHX单独或者联合使用检测Flag-hnRNP K和Flag-hnRNP K K422R蛋白的降解途径;利用IP检测Flag-hnRNP K和Flag-hnRNP K K422R的泛素化差异;利用CHX检测Flag-hnRNP K蛋白和Flag-hnRNP K K422R蛋白稳定性差异。6.利用CIF检测Flag-hnRNP K和Flag-hnRNP K K422R稳转细胞系的Flag的分布;利用胞核与胞浆分离技术检测Flag-hnRNP K和Flag-hnRNP K K422R蛋白的分布;通过裸鼠皮下移植瘤实验检测转染psin-vector、psin-Flag-hnRNP K和psin-Flag-hnRNP K K422R质粒的BGC823细胞增殖成瘤能力。研究结果1.在胃癌组织中hnRNP K呈现高表达,并且分化程度越低的组织表达越高;与GES-1细胞相比,胃癌细胞中hnRNP K的蛋白高表达。2.不管是在正常胃上皮细胞还是胃癌细胞中,hnRNP K都是主要分布在核内;在BGC823细胞中转染Flag-hnRNP K质粒后,细胞裸鼠皮下移植瘤与空载组比瘤体体积显著增大,并且转染Flag-hnRNP K后的细胞c-myc的蛋白和mRNA水平同时显著上调。3.利用MG132和CHX处理GES-1和BGC823后,MG132能够拮抗CHX导致的hnRNP K快速降解,延缓代谢进程;而利用CQ处理细胞则对hnRNP K的降解无明显影响。4.在正常胃上皮组织和胃癌组织或细胞中,hnRNP K的mRNA水平无差异;hnRNP K还主要通过蛋白酶体途径降解。5.与正常胃上皮组织相比较,胃癌组织中的sumo修饰水平更高,同时泛素修饰水平更低;与胃正常上皮相比,胃癌细胞中的sumo修饰水平更高,泛素修饰水平更低;与Flag-hnRNP K K422R稳转系相比,Flag-hnRNP K的蛋白稳定性更高,泛素修饰水平相对较低;Flag-hnRNP K和Flag-hnRNP K K422R蛋白的降解途径都是蛋白酶体途径。6.Flag-hnRNP K和Flag-hnRNP K K422R蛋白都是主要均匀分布在核内,且都能发挥促进肿瘤增殖的作用。研究结论1.与正常胃上皮相比,hnRNP K在胃癌组织和细胞中都呈过表达状态,主要分布在核内,并且过表达hnRNP K能够促进肿瘤生长进程,与对照组相比,裸鼠皮下移植瘤瘤体体积增大显著。2.hnRNP K在胃癌细胞中呈低泛素化高sumo修饰状态,通过蛋白酶体途径降解,hnRNP K的sumo位点突变后不会改变它的分布,去sumo化状态的hnRNP K发挥促肿瘤发展功能。