杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)属于单科单属落叶乔木,别名为胶木,因其具有广泛的胶用和药用价值而成为我国的一种特有经济树种。药用杜仲,即为杜仲的干燥树皮,其中发挥医疗作用的成分主要是黄酮类、木脂素类、苯丙素类等化合物,可以用于调节血压、抗肿瘤、抗菌抗病毒、保肝护肾等。漆酶(Laccase,LAC)是属于铜蓝氧化酶蛋白家族的一种含四个铜离子的糖蛋白氧化酶,在高等植物中主要影响木质素的合成、植物体内酚类物质含量的调控以及参与到植物对病虫害的抵御等。目前,对于真菌漆酶的研究和应用比较深入和广泛,但是关于植物漆酶的研究报道相对较少且其功能机制有待进一步证明。因此,为对杜仲漆酶基因的功能进行研究分析,本研究克隆了杜仲漆酶编码基因EuLAC1,对其进行了生物信息学分析,以及对其在杜仲组织器官中的表达特征进行分析,并构建了植物过表达载体p CAMBIA1300-35S-EuLAC1,然后遗传转化烟草,用获得的转基因烟草验证分析EuLAC1基因的功能。取得如下结果:1 EuLAC1的克隆及生物信息学特征根据本实验室前期构建的杜仲基因组数据库注释信息设计引物EuLAC1-F和EuLAC1-R,以杜仲c DNA为模板进行PCR扩增,获得目的条带,经过测序拼接得到全长为1617 bp的EuLAC1基因CDS序列,共编码538个氨基酸。对EuLAC1基因编码的蛋白结构域进行分析,发现该序列中含有三个铜氧还蛋白结构域,属于铜蓝氧化酶蛋白家族的一员,符合漆酶的基本特征,命名为EuLAC1。进一步对EuLAC1蛋白结构进行预测,分析结果发现,该蛋白含有1个信号肽,不具备跨膜结构。该蛋白的二级结构主要由无规则卷曲和延伸链组成。与拟南芥漆酶的氨基酸序列同源性分析发现其与At LAC17氨基酸序列相似性最高,而已有研究表明At LAC17参与木质素的合成。2 EuLAC1组织特异性表达特征实验表明EuLAC1在幼树期杜仲中的表达量更高,而在幼苗期杜仲植株中相对各部位的表达量要低的多。其中,幼树期植株茎中的表达量是幼苗期植株茎的28.24倍。除此之外,杜仲漆酶基因EuLAC1在茎中的表达量最高,在叶中的表达量最低,幼树期杜仲茎中的表达量分别是同时期叶的30.29倍,根的3.54倍。3 EuLAC1遗传转化烟草对灰霉病抗性的影响将构建的植物过表达载体p CAMBIA1300-35S-EuLAC1,通过农杆菌介导遗传转化到烟草中。经过潮霉素筛选,Gus染色以及目的条带的PCR扩增鉴定后一共得到26个转基因株系。用q RT-PCR检测转基因烟草株系中EuLAC1的表达量,然后选取表达量较高,长势良好的四个转基因株系进行后续生理生化实验。本研究测定了野生型和转EuLAC1烟草的漆酶活性和木质素含量,并且进行了烟草灰霉病抗性实验。漆酶活性的测定实验表明,在转基因植株株系中的漆酶活性显著增加,同时与对照植株相比,转基因烟草的叶和茎中的木质素含量都有明显的增加。使用扫描电镜观察野生型和转基因烟草的茎段横截面,结果发现转基因烟草木质部导管附近的细胞壁比野生型厚,轮廓更加分明。采用离体叶片接种法分析EuLAC1基因对烟草灰霉病抗性的影响,结果表明,过表达EuLAC1基因能够提高烟草对灰霉病的抗性。综上所述,推测在转EuLAC1基因的烟草中,由于增加的漆酶活性而导致的木质素含量的提高加强了烟草对灰霉病的抗性。而它的抗病机制是否是因为木质素的增加使木质化程度加强引起的细胞壁的增厚尚待进一步的研究。