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第一部分 川崎病患儿急性期血小板中差异表达microRNAs的筛选研究目的:利用高通量测序技术(“Next-generation”sequencing technology,NGS)获得川崎病(Kawasaki disease,KD)急性期患儿和其它发热性疾病(Other febrile illness,OFI)患儿血小板内miRNAs的表达图谱,筛选川崎病急性期显著差异表达的miRNAs,进一步探讨KD血管炎症的发生机制。方法:选取我院住院的急性期KD患儿16例,及其他发热性疾病患儿16例作为对照,清晨抽取空腹血,分离血小板,对血小板RNA进行miRNA测序文库构建和测序,采用高通量测序技术检测川崎病组及对照组血小板中差异表达的miRNAs。利用TargetScan,miRanda和MirTarget2三种预测工具对差异miRNAs进行靶基因预测,使用DAVID生物信息学分析软件对共同的靶基因进行GO和KEGG分析,寻找可能参与KD血管炎症相关的靶基因及信号通路。结果:在OFI和KD患者的血小板中分别检测到123和121个miRNAs。KD患者血小板中最丰富的microRNA是let-7 microRNA家族的成员,占血小板microRNA含量的42.84%。在KD或OFI患者血小板中表达的miRNAs中,火山图显示35个miRNAs差异调节,平均CPM变化超过2倍,P<0.01。KD患者血小板中有12个miRNAs表达上调,23个miRNAs表达下调。结论:miR-222-3p在急性KD患者的血小板中显著上调。KEGG通路分析表明,miR-222-3p的靶标富含免疫炎症相关的信号通路。血小板中miR-222-3p具备作为早期诊断川崎病的生物标志物的潜力。第二部分 通过机器学习建立川崎病早期诊断预测模型目的:使用筛选出的miRNAs作为特征,通过机器学习方法建立川崎病患病预测模型,并优化模型提高预测准确性。方法:使用筛选出的35个miRNAs作为生物分子标志物,选取了 Linear SVM、RBF SVM、Nearest Neighbors、Decision Tree、Random Forest、Na(?)ve Bayes、AdaBoost、LDA、QDA等9种模型进行模型建立,再通过Linear SVM结合随机森林的机器学习方法,建立了预测模型并在150例样本上进行了模型验证和优化。结果:以差异表达的35个miRNAs为特征,用22例样本(11例KD和11例OFI)建立随机森林分类器(RFC)模型。参数通过贝叶斯优化进行优化,并用于训练模型。通过询问剩余的150例样本(75例KD和75例OFI),进一步检验了模型的泛化能力。通过将预测结果与真实样本类别进行比较,生成了受试者操作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线,曲线下面积(area under curve,AUC)达到 0.94。结论:改进优化机器学习模型后,Linear SVM结合随机森林方法建立预测川崎病的预测模型,预测准确度达到0.94,并且可以较为清晰分辨KD和OFI,该分类预测模型的建立对川崎病早期辅助诊断具备良好的应用前景。第三部分miR-222-3p在川崎病血管炎中可能的作用机制探讨目的:我们通过预测miR-222-3p的靶基因,分析与血管炎相关的基因、细胞因子和信号通路,结合荧光定量PCR技术验证相关基因及细胞因子表达调控关系,探讨miR-222-3p在川崎病血管炎中可能的作用机制。方法:我们使用TargetScan,miRanda和MirTarget2等多种靶基因预测工具对miR-222-3p可能的目的基因进行预测,并运用DAVID分析功能及KEGG富集通路,得到与血管炎相关的基因、细胞因子及信号通路。我们再通过JASPAR和cytoscape对细胞因子和靶基因及信号通路间的网络互作关系进行预测,最后使用荧光定量PCR进行表达验证。结果:通过富集预测到的miR-222-3p 靶基因,发现IL-1家族信号通路在miR-222-3p的靶基因信号通路中,同时发现SMAD5基因受到miR-222-3p的表达调控,并且通过预测发现SMAD5基因可以结合在IL-37基因启动子区域激活其抗炎作用,最后通过荧光定量PCR分析健康儿童、KD患儿、OFI患儿外周血中miR-222-3p、SMAD5及IL37因子表达,发现川崎患儿中的miR-222-3p高表达,而SMAD5和IL-37却是低表达的。结论:我们通过预测miR-222-3p的靶基因和通路富集,找到了IL-1家族信号通路在miR-222-3p的靶基因信号通路中,同时发现SMAD5基因受到miR-222-3p的表达调控。我们使用cytoscape和JASPAR预测了 SMAD5基因可以结合在IL-37基因启动子区域,并使用荧光定量PCR检测健康儿童、KD患儿和OFI患儿血液中miR-222-3p、IL-37及SMAD5的表达,发现IL-37和SMAD5的表达趋势相同而与miR-222-3p相反,从而合理假设miR-222-3p在川崎患儿中上调导致SMAD5基因表达下调,继而下调了IL-37降低其抗炎活性,从而引发血管炎,这可能是川崎病血管炎全新的一种发病机制,但miR-222-3p、SMAD5及IL37三者间的关系需要细胞实验乃至动物模型来进一步验证。