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研究背景和意义破骨细胞的骨吸收能力和成骨细胞的成骨能力保持平衡才能维持机体的骨稳态。破骨细胞过度分化、功能亢进可导致骨质疏松症、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)、Paget病等疾病。至今,RA的发病机制仍未完全阐明,研究RA的发病机制具有重要意义。RA晚期患者的髋、膝等大关节破坏严重,导致疼痛、畸形、功能障碍,常需进行关节置换术治疗。由于长期使用激素和慢性类风湿炎症反应,常导致RA患者关节病理性骨量丢失严重,骨强度和骨质量情况极度恶化,更容易出现关节置换术中、术后假体周围骨折以及术后假体松动等并发症。这与破骨细胞的过度分化、功能亢进密切相关。目前,RA患者骨量丢失、骨质极度疏松的发病机制仍未完全清楚。临床上尚缺乏有效防治RA病理性骨量丢失的方法。有研究表明RA患者的血清、滑膜组织、关节液及关节脂肪组织中的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)的含量明显增高;而且HGF能够促使人外周血单核细胞向破骨细胞分化。这提示HGF对于RA中破骨细胞的分化可能存在调控作用。本研究中,我们拟通过离体、在体实验探索HGF对RA中破骨细胞分化的调控作用。研究目的明确HGF促进RA患者破骨细胞分化的作用;探究HGF促进破骨细胞分化的分子机制;明确抑制HGF能够减缓RA模型小鼠——胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠的骨量丢失。研究方法为了明确HGF促进RA患者破骨细胞分化的作用,我们收集接受膝关节表面置换手术治疗的RA、骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者的膝关节腔内的滑膜组织,提取总蛋白及切片,通过Western blot、免疫荧光染色检测不同患者滑膜组织中HGF的表达情况。分别选用小鼠RAW 264.7细胞、原代小鼠骨髓单核巨噬细胞(bone marrow monocytes,BMMs),分为 Control 组、RANKL 组、RANKL+HGF 组,诱导 3 天后,进行TRAP染色、破骨细胞计数。选用小鼠RAW 264.7细胞、原代细胞BMMs,分为Control组、DMSO组、SU11274组,各组又分为Ⅰ、Ⅱ两个亚组。Ⅰ亚组细胞中加入RANKL 50 ng/mL,Ⅱ亚组中同时加入50 ng/mL的RANKL和HGF。孵育3天后进行细胞的TRAP染色,并行破骨细胞计数。选用小鼠RAW 264.7细胞、原代BMMs,接种在骨基质表面培养板上,分为Control组、RANKL组、RANKL+HGF组、RANKL+HGF+SU11274组,诱导7天后使用Image J(v1.8.0)软件计算骨吸收陷窝面积。为了探究HGF促进破骨细胞分化的分子机制,我们用RANKL、HGF和SU11274等处理RAW264.7细胞3天后,使用q-PCR技术检测nfatc1、acp5、ctsk等破骨细胞相关基因的表达水平。用HGF分别对RAW 264.7细胞进行处理,行Western blot检测细胞中的 JNK 和 Akt-GSK-3β-NFATc1 信号通路(c-Met、p-Met、Akt、p-Akt、GSK-3(β、p-GSK-3β)以及细胞胞质和胞核内NFATc1的表达情况。为明确抑制HGF能够减缓RA模型小鼠的骨量丢失,建立CIA小鼠模型,选取Control组、CIA组小鼠后肢踝关节组织,提取总RNA、蛋白,通过q-PCR、Western blot检测小鼠组织中HGF的mRNA及蛋白的表达情况。对CIA小鼠腹腔内注射SU11274,定期行小鼠RA临床评分并收集标本。左侧后肢胫骨行micro-CT检查,检测BMD和BV/TV等指标。左侧后肢股骨下段固定、脱钙后切片行抗酒石酸酸性磷酸酶染色(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP),破骨细胞计数。定量数据以均数±标准差表示。使用SPSS 20.0软件,两组间行t检验,多组间行单因素方差分析以及用posthoc Bonferroni检验进行多重比较。p<0.05差异有统计学意义。所有实验均至少重复三次。结果HGF处理后,增强了小鼠RAW 264.7细胞和BMMs的破骨细胞分化和骨吸收能力;激活了 RAW 264.7细胞中的Akt-GSK-3β-NFATc1信号通路及JNK。SU11274处理后,HGF作用下RAW 264.7细胞表现出Akt-GSK-3β-NFATc1信号通路活化水平大幅度降低。HGF刺激下,破骨细胞相关基因nfatc1、acp5、ctsk的表达明显增强。RA患者膝关节滑膜组织和CIA小鼠踝关节组织中HGF的mRNA及蛋白表达大幅升高。SU11274处理后,CIA小鼠的RA临床评分和股骨远端破骨细胞数量明显减少,明显缓解病理性骨量丢失。结论HGF能够促进破骨细胞分化并增强其骨吸收能力;HGF促进破骨细胞分化的机制是激活破骨前体细胞中的JNK和Akt-GSK-3β-NFATc1信号通路,进而促进NFATc1的核转运;抑制HGF的作用能够减缓CIA小鼠的病理性骨量丢失和炎性症状。