【摘 要】
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目的探讨去唾液酸糖蛋白受体1（asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1）对肝细胞脂质摄取的影响及作用机制。方法（1）利用试剂盒检测正常饮食（standard diet,SD）及高脂饮食（high fat diet,HFD）喂养载脂蛋白E基因敲除(Apo E-/-)小鼠血清中的总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglycerides,T
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（81770454）； 湖南卫健委2020年重点指导课题（20201905）；
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目的探讨去唾液酸糖蛋白受体1（asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1）对肝细胞脂质摄取的影响及作用机制。方法（1）利用试剂盒检测正常饮食（standard diet,SD）及高脂饮食（high fat diet,HFD）喂养载脂蛋白E基因敲除(Apo E-/-)小鼠血清中的总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglycerides,TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipopreotein cholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipopreotein cholesterol,LDL-C）的水平;免疫组织化学法检测ASGR1、前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin kexin type 9,PCSK9）、低密度脂蛋白受体（low-density lipoprotein receptor,LDLR）在小鼠肝脏中的表达。（2）分别采用不同浓度（0、10、25、50、75μg/m L）低密度脂蛋白受体（low-density lipoprotein receptor,LDL）处理两种肝细胞系Hep G2和Huh7,实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative Real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-q PCR）和Western blot分别检测细胞ASGR1 m RNA和蛋白质的表达;随后使用25μg/m L的LDL处理Hep G2和huh7细胞不同时间（0、6、12、24、48 h）,Western blot检测细胞ASGR1蛋白质的表达。（3）利用生物信息学手段筛选ASGR1的候选转录因子,分析候选转录因子与ASGR1是否存在特异性结合位点;25μg/m L LDL处理Hep G2细胞24 h后,实时荧光定量PCR检测候选转录因子m RNA的表达。（4）将ASGR1小分子干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）转染Hep G2细胞,RT-q PCR和Western blot检测细胞内ASGR1 m RNA及蛋白质的表达。随后不予以或予以LDL处理,氟化硼络合二吡咯甲川类（Boron-dipyrromethene,BODIPY）荧光染色、油红O染色检测Hep G2细胞内脂质情况,以20μg/m L的红色荧光标记的人源低密度脂蛋白（Human Dil-LDL）孵育ASGR1 si RNA转染的Hep G2细胞4 h,荧光显微镜检测细胞对Dil-LDL的摄取能力。（5）ASGR1 si RNA转染Hep G2,Western blot检测LDLR及PCSK9蛋白质的表达。结果（1）胆固醇试剂盒检测结果显示:相较于SD组,HFD喂养的Apo E-/-小鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量增高。免疫组织化学结果显示,HFD喂养Apo E-/-小鼠肝脏组织中ASGR1表达增多,LDLR表达降低,PCSK9表达增高。（2）RT-q PCR和Western blot结果显示LDL上调Hep G2和Huh7细胞系ASGR1的m RNA和蛋白质表达,呈浓度依赖性。使用25μg/m L LDL分别处理两种肝细胞不同时间后,随着LDL处理时间的增加,细胞中ASGR1中蛋白质表达逐渐增加。（3）生物信息学分析结果筛选出8个候选转录因子,可能参与调控ASGR1表达;motif软件进一步分析出ASGR1基因启动子序列上可能存在其中4个候选转录因子的结合位点;RT-q PCR显示,LDL处理的Hep G2细胞中,4个转录因子的m RNA水平没有明显改变。（4）ASGR1 si RNA明显降低Hep G2细胞中ASGR1的m RNA和蛋白质的表达。Bodipy荧光染色和油红O染色结果显示:与LDL处理相比,ASGR1 si RNA+LDL促进Hep G2和Huh7细胞内脂质蓄积;荧光显微镜观察显示,低表达ASGR1提高Hep G2细胞对Dil-LDL的摄取能力。（5）Western blot结果显示,在LDL处理的Hep G2细胞中,ASGR1低表达能够上调LDLR的蛋白表达、下调PCSK9的蛋白的表达。结论（1）HFD喂养Apo E-/-小鼠肝脏中ASGR1表达明显增加,LDL可以上调肝细胞内ASGR1 m RNA和蛋白质的表达;（2）ASGR1低表达可以增强肝细胞对LDL的摄取能力,其机制可能与下调PCSK9表达,上调LDLR的表达有关。
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