【摘 要】
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右旋糖酐酶能够特异性水解葡聚糖中的α-1,6糖苷键,在降解蔗汁中右旋糖酐和益生元的制备方面具有良好的应用前景。本研究从海洋中筛选到一株产右旋糖酐酶的菌株,对该菌株生长特性、产酶条件、酶学性质及水解产物进行了研究,主要结果如下:筛选到了一株产酶菌株G6-4B,并鉴定为氧化节杆菌（Arthrobacter oxydans）,该菌株为革兰氏阴性细菌,无芽孢,无鞭毛,菌体呈短杆状,在含有蓝色葡聚糖的平板上
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右旋糖酐酶能够特异性水解葡聚糖中的α-1,6糖苷键,在降解蔗汁中右旋糖酐和益生元的制备方面具有良好的应用前景。本研究从海洋中筛选到一株产右旋糖酐酶的菌株,对该菌株生长特性、产酶条件、酶学性质及水解产物进行了研究,主要结果如下:筛选到了一株产酶菌株G6-4B,并鉴定为氧化节杆菌（Arthrobacter oxydans）,该菌株为革兰氏阴性细菌,无芽孢,无鞭毛,菌体呈短杆状,在含有蓝色葡聚糖的平板上,菌落边缘整齐光滑、浅白湿润。该菌株甲基红反应呈阳性,精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶实验呈阴性,能够利用葡萄糖、麦芽二糖、蔗糖等。通过对菌株G6-4B生长条件研究发现:该菌株的最适生长温度为30℃,最适生长p H为7.0,最适生长氯化钠浓度为10 g/L。提取菌株G6-4B基因组送往诺禾致源公司对其全基因组进行测序,根据测序结果分析该菌株基因组信息,找出编码右旋糖酐酶的氨基酸序列,根据氨基酸序列同源性,将氧化节杆菌G6-4B右旋糖酐酶归于糖苷水解酶GH49家族,根据氨基酸序列使用在线软件Ex Pasy与Signal P推测酶蛋白的分子量大小及信号肽等相关信息。得出该菌株所产右旋糖酐酶的分子量为71.12 k Da,N端有32个氨基酸的信号肽,GC总含量占比为66.6%。通过单因素优化试验确定氧化节杆菌G6-4B的最佳产酶条件为:产酶温度为25℃,培养基初始p H为7.5,发酵时间为48 h,最佳接种量为4%,诱导剂浓度为10 g/L。在上述条件下得到的发酵液,经离心制备成粗酶液后,测得酶活为18.2 U/m L。对氧化节杆菌G6-4B右旋糖酐酶进行了纯化和酶学性质研究:通过硫酸铵沉淀、超滤和离子交换层析等手段对酶进行纯化,纯化后酶的回收率为10.88%,比酶活为337.69U/mg,纯化倍数为32.25。酶的分子量约70 k Da,最适作用温度为55℃,50℃条件下保温5 h仍有80%以上的剩余酶活,酶在p H 7.0-9.0范围之间稳定。大多数金属离子在不同程度上对氧化节杆菌G6-4B右旋糖酐酶酶活力有抑制作用,并且随着离子浓度的增强,对酶的抑制作用增强,其中Ni2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+离子终浓度在1 m M到10 m M时能够完全抑制氧化节杆菌G6-4B右旋糖酐酶酶活力;吐温80对氧化节杆菌G6-4B右旋糖酐酶酶活力有一定的促进作用,而β-巯基乙醇对该酶酶活力有强烈抑制作用,加入β-巯基乙醇后,该酶丧失酶活;通过酶的特异性实验验证了该酶只能特异性水解α-1,6糖苷键;亲和性随着底物右旋糖酐的分子量的增大而增强。对氧化节杆菌G6-4B右旋糖酐酶的水解产物及应用进行研究发现:氧化节杆菌G6-4B右旋糖酐酶是一种内切型右旋糖酐酶,可随机性水解葡聚糖中的α-1,6-糖苷键。相比较于水解时间和底物的聚合度,氧化节杆菌G6-4B右旋糖酐酶的酶浓度对水解产物的种类和比例影响显著。用酶浓度为5 U/m L的G6-4B右旋糖酐酶粗酶液于55℃温度下水解0.5%右旋糖酐T20后得到的水解产物用LC-MS分析,产物中IMO3含量高达73.19%,其次为11.58%的异麦芽四糖,异麦芽六糖和异麦芽七糖所占比例分别为8.03%和7.19%。用氧化节杆菌G6-4B右旋糖酐酶水解产物做益生元活性实验,验证了其水解产物在一定程度上有增殖有益菌、抑制有害菌的效果。该论文有图24幅,表16个,参考文献115篇。
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