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目的：
结肠粘膜是一种兼有吸收和分泌双重功能的上皮组织,它的一项重要生理功能就是调节水、电解质的吸收和分泌,这种作用受多种神经递质、激素及炎症介质的调控。基础状态下,结肠上皮通过粘膜侧氨氯吡咪敏感的Na+通道及基侧Na+-K+-ATP酶协同作用主动吸收Na+,驱动肠腔中的水液吸收至血液循环；另外,Na+-K+-ATP酶作用形成的Na+梯度可激活基侧丁氧苯酸敏感的Na+-K+-2Cl-复合体,将血液中Cl-转运入胞浆,蓄积在上皮细胞内的Cl-则通过粘膜侧Cl-通道顺电化学梯度分泌至肠腔,继而由Cl-分泌所形成的电化学梯度再驱使阳离子和水液向肠腔被动转运。病理状况下,结肠上皮Cl-通道功能发生调节紊乱,分泌亢进或吸收下降均可能导致腹泻,反之则造成便秘。
黄连是治疗消化系统疾病的常用中药,可用于治疗多种腹泻。其主要成分是小檗碱,巴马丁,药根碱等原小檗类生物碱。前人对黄连抗腹泻作用的研究多集中在抗炎,抑杀病原体方面,而对其影响肠粘膜电解质转运方面的研究很少,仅限于小檗碱,认为小檗碱通过阻断结肠粘膜基侧的钾离子通道抑制结肠上皮的电解质转运,然而其它原小檗类生物碱是否同样具有抗分泌的作用,是否也通过影响离子转运而发挥作用还不清楚。因此,本实验观察并探讨了巴马丁对大鼠结肠粘膜电解质转运的作用及可能的机制,希望为黄连的临床应用提供科学的依据,进一步拓展原小檗类生物碱在胃肠疾病治疗领域的地位。
方法：
应用上皮电压钳技术结合离子替代,通道阻断,受体拮抗等方法记录巴马丁对短路电流,顶侧膜Cl-流,顶侧膜K+流及基侧膜K+流的影响。以Fura-2AM技术测量巴马丁对细胞内钙离子浓度的影响。
结果：
在大鼠结肠粘膜基侧加入50μM卡巴胆碱可刺激短路电流(Isc)增加,且呈瞬时相和持续相变化,两相Isc分别为218.8±13.5 μAcm-2和81.0±4.7 μAcm-2。用巴马丁(100μM,基侧)预孵育30分钟后,再加卡巴胆碱(50μM,基侧),瞬时相和持续相Isc的反应为18.0±5.0 μAcm-2和10.3±3.1 μAcm-2,与对照组比较,分别抑制了91.8％和87.3％(P<0.01)。细胞内Ca2+测定结果表明,用50μM卡巴胆碱灌流液灌3min内,荧光强度340/380比值从0.61±0.02上升到0.97±0.02,用100μM巴马丁孵育30min后,再用卡巴胆碱灌流,只有小幅上升,从0.61±0.02上升到0.69±0.02(与对照组比较,P<0.01)。分别用1,3,10,30,100,300 μM巴马丁预孵育,可浓度依赖性地抑制卡巴胆碱升高[Ca2+]i的作用,IC50为13.46±3.15 μM。用丁氧苯酸(100μM,基侧)阻断Na+-K+-2Cl-复合转运体后,卡巴胆碱升高结肠粘膜Isc的作用被大部分抑制,瞬时相和持续相Isc反应分别为45.0±9.3 μcm-2和27.0±7.7 μAcm-2,与对照组比较,抑制了79.2％和74.0％(P<0.01)。去除溶液中的Cl-后,再加入卡巴胆碱,瞬时相和持续相Isc反应分别为49.8±6.4 μAcm-2和20.5±3.3 μAcm-2,与对照组比较,抑制了78.5％和80.1％(P<0.01)。进一步测定细胞外Ca2+对卡巴胆碱升高Isc作用的影响,发现顶侧用无钙溶液替换不影响卡巴胆碱的作用(对照组瞬时相和持续相Isc为238.0±14.18μAcm-2和92.3±7.6μAcm-2;顶侧用无钙溶液组两相Isc为220.7±18.1 μAcm-2和95.3±9.7 μAcm-2)。但基侧用无钙溶液替换后卡巴胆碱的作用受到抑制,瞬时相和持续相Isc的反应为119.7±7.1 μAcm-2和9.3±3.0 μAcm-2,与对照组比较,分别抑制了49.7％,89.9％(P<0.01)。结肠粘膜双侧加入101μM雷诺丁,激活细胞内钙库后,Isc升高了22.0±1.9 μAcm-2;基侧用100μM巴马丁预孵育30min,再加入雷诺丁,Isc反应为5.0±1.8 μAcm-2,与对照组比较,抑制了77.3％(P<0.01)。加入1μM毒胡萝卜素,阻断Ca2+-ATP酶后,Isc升高了46.3±4.6 μA/cm2;用巴马丁预孵育30min,再加入毒胡萝卜素,Isc反应为44.7±5.2 μA/cm2,与对照组比较无显著差异。在顶侧Cl-测定实验中,分别用巴马丁(100μM,基侧),非选择性CFTR/Cl-通道阻断剂Glibenclamide(500μM,顶侧),Ca2+依赖性Cl-通道阻断剂DIDS(500μM,顶侧)和SITS(100μM,顶侧)预孵育30min,发现卡巴胆碱升高I(ap)Cl的作用只被SITS抑制(P<0.01)。顶侧K+测定结果表明,结肠粘膜基侧加入50μM卡巴胆碱可激活顶侧K+通道,产生内向双相电流。分别用1,3,10,30,100,300 μM巴马丁预孵育30min后,再加入卡巴胆碱,其作用受到浓度依赖性的抑制,瞬时相和持续相的IC50分别为23.1±5.5 μ和14.0±7.5μM。用ChTX(100nm,顶侧)预孵育30min,卡巴胆碱引起的I(ap)K显著被抑制(瞬时相I(ap)K反应为-11.0±0.4 μAcm-2,与对照组比较,P<0.01;持续相反应为-6.5±0.3 μAcm-2,与对照组比较,P<0.05)。用TEA(5mM,顶侧)预孵育30min,再加卡巴胆碱,瞬时相I(ap)K反应为-14.0±1.3 μA/cm2,与对照组比较受到显著抑制(P<0.05),持续相I(ap)K反应为-7.6±1.3 μAcm-2,与对照组比较无明显差异(P>0.05)。基侧K+测定结果表明,基侧加50μM卡巴胆碱,可激活基侧K+通道,引起两个峰(一个小尖峰和随后的一个高峰)。分别用1,3,10,30,100,300 μM巴马丁预孵育后,卡巴胆碱升高I(ap)K的作用被浓度依赖性地抑制,第一峰和第二峰IC50分别为37.9±17.1 μM和14.9±2.1 μM。分别用Ca2+激活的K+通道阻断剂ChTX(100nM,基侧),cAMP激活的K+通道阻断剂293B(30μM,基侧),以及两种基侧K+通道的双重阻断剂CLT(30μM,基侧)预孵育,发现两峰均可被ChTX和CLI抑制(均P<0.01),而对293B对不敏感(P>0.05)。
结论：
1.巴马丁能抑制卡巴胆碱诱导的Ca2+激活的Cl-分泌。
2.巴马丁抑制Cl-分泌的作用与降低细胞内Ca2+浓度有关,Ca2+浓度的降低除与巴马丁抑制IP3敏感的钙库激活有关,还与抑制雷诺丁敏感的钙库激活有关,而与钙库再摄取无关。
3.巴马丁抑制Cl-分泌的作用与顶侧Cl-通道无关,与顶侧Ca2+激活的K+通道以及基侧Ca2+激活的SK4/K+通道有关。