背景:乳腺癌是乳腺组织内细胞失控增殖癌变形成的恶性肿瘤,是女性患病率最高的癌症。根据统计资料显示,大概八分之一的女性（13%）在一生中可能会被诊断出乳腺癌。其发生机制尚不完全明确,除去家族史,乳腺癌前病变（非典型增生,原位癌）,基因突变（BRCA1,BRCA2,PALB2,TP53,PTEN等）这些高危风险因素外,其它已知的乳腺癌相关风险因素有高雌激素暴露（初潮过早或绝经过晚,激素药物补充）、无孕史、无哺乳史、胸部放射治疗和腺体增生等。此外,作为多种癌症的风险因素,年长、肥胖、饮酒、吸烟、缺乏运动以及环境射线及化学品暴露也可以引起乳腺癌发病风险增加。虽然乳腺癌的发病机制尚未完全明确,但是相关科学研究已经发现了诸多与乳腺癌发生发展密切相关的分子,并尝试将其作为靶点来治疗乳腺癌,例如针对HER2,ER,CDK4/6,PI3K等分子的靶向抑制剂已经投入临床使用。信号转导和转录激活因子5（Signal transducers and activators of transcription 5,STAT5）,作为信号转导和转录激活因子家族（STATs）七个分子成员之一,参与调控多个基因的表达,与细胞增殖、分化、凋亡和免疫密切相关。STAT5是与乳腺发育关系最密切的STAT分子,它具有两个相似度90%的亚型,STAT5a和STAT5b,其中STAT5a是乳腺中发挥主要功能的亚型,STAT5a缺失可以导致哺乳不良。在细胞质中被Janus激酶2（Janus Kinase 2,JAK2）磷酸化的STAT5分子（phosphorylated STAT5,p STAT5）可以形成同源二聚体或者异源二聚体进入细胞核中,与目标基因序列的启动子区域相结合,从而调节基因的表达。在乳腺中,JAK2/STAT5通路可以诱导乳腺上皮细胞成熟分化、小叶-腺泡结构形成和乳液蛋白分泌,进而发挥哺乳功能。根据实验报导,STAT5分子与多种癌症的形成有关,包括乳腺癌、前列腺癌、肝癌和头颈癌等。有报道发现大约20%-70%的临床乳腺癌标本有STAT5的表达。实验证明STAT5的表达可以加速包括乳腺癌在内的多种癌症的形成和进展。有趣的是,与其它癌症不同,乳腺癌中STAT5的作用具有两面性,一方面,它可以加速乳腺癌肿瘤形成,另一方面,它可以促进肿瘤组织的分化。此外,临床乳腺癌病人数据表明,STAT5高表达的患者,转移率更低,生存期更长,临床预后更好。目的:基于本课题组先前研究成果,本研究计划通过构建多个小鼠乳腺癌模型并结合细胞实验,探究STAT5对乳腺癌形成、分化和转移的影响,并使用生物信息学技术对临床患者数据进行生存分析,揭示STAT5表达水平与患者预后的关系。旨在探究STAT5在乳腺癌肿瘤形成、分化和转移过程中发挥的双向作用及其可能的分子机制,并进一步证明STAT5可作为临床乳腺癌预后评估的生物标记物。方法:（1）扩增携带致癌基因或者STAT5a的DNA质粒,并构建两对（四个）病毒颗粒:携带持续激活Erb B2（HER2）的逆转录病毒载体RCAS-Erb B2ca;携带持续激活Stat5a基因的逆转录病毒载体RCAS-Stat5aca;携带变异PIK3CA基因(PIK3CAH1047R)的慢病毒载体FUCGW-PIK3CAH1047R;携带持续激活Stat5a基因的慢病毒载体FUW-Stat5aca。（2）构建小鼠HER2+乳腺癌前病变模型:通过乳导管注射技术,使RCAS-Erb B2ca和RCAS-Stat5aca共同感染MMTV-tva（MA）转基因小鼠乳腺上皮细胞,2周后收集乳腺组织,通过苏木精-伊红染色（HE）和免疫组织化学染色（IHC）确定癌前病变的组织学特点及STAT5的过表达。（3）构建小鼠原发HER2+乳腺癌模型:通过乳导管注射技术,使RCAS-Erb B2ca单独或和RCAS-Stat5aca共同感染MA转基因小鼠乳腺上皮细胞,随后进行一周两次的乳腺触诊,持续监测肿瘤形成,待小鼠达到伦理学终点后,处死小鼠并收集肿瘤和肺组织。通过HE染色和IHC染色确定肿瘤组织的组织学特点及STAT5a的表达,并通过Western blot和IHC来检测肿瘤组织内抗凋亡分子BCL-2和BCL-XL的蛋白表达。通过肺组织切片HE染色寻找肺转移灶。（4）构建小鼠原发ER+乳腺癌模型:通过乳导管注射技术,使FUCGW-PIK3CAH1047R单独或者和FUW-Stat5aca共同感染FVB小鼠乳腺上皮细胞,随后进行一周两次的乳腺触诊,持续监测肿瘤形成,待小鼠达到伦理学终点后,处死小鼠并收集肿瘤组织。通过HE染色和IHC染色确定肿瘤组织的组织学特点及STAT5a的表达。（5）构建STAT5a稳定过表达的人类乳腺癌细胞系MCF-10A和MCF-7:使用FUCGW空载体,FUCGW-PIK3CAH1047R,FUW-Stat5aca病毒质粒单独或者联合感染MCF-10A细胞,通过流式细胞术进行筛选并传代培养,得到STAT5a过表达且携带PIK3CAH1047R的MCF-10A细胞;使用FUW-Stat5aca感染MCF-7细胞,通过流式细胞术进行筛选并传代培养,得到STAT5a过表达的MCF-7细胞。（6）构建人类乳腺癌细胞系小鼠乳导管内原位增值模型:分别将MCF10A-PIK3CAH1047R和MCF10A-PIK3CAH1047R/STAT5aca注射进入免疫缺陷的NSG小鼠乳导管内,使其原位增殖形成癌灶,使用IVIS小鼠全身荧光成像技术,监测肿瘤生长,待小鼠达到伦理学终点后,处死小鼠并收集全身可能发生转移的器官。对全身器官进行荧光强度检测来确定转移情况。（7）应用IHC及免疫荧光染色（IF）技术对收集到的乳腺癌前病变和肿瘤组织石蜡切片进行染色,探究STAT5对功能分化相关标志分子β-casein和perilipin-2（PLIN-2）的蛋白水平影响。（8）应用细胞体外侵袭和迁移实验检测STAT5a对MCF-10A和MCF-7细胞局部侵袭能力的影响。（9）利用反向蛋白微阵列技术（RPPA）对冷冻小鼠ER+乳腺癌组织进行蛋白组学分析,探究STAT5影响乳腺癌转移的分子机制,并通过实时定量PCR（RT-q PCR）和蛋白质印迹实验（Western blot）,在小鼠乳腺癌组织和人类细胞系中验证STAT5a对细胞EMT过程的影响。（10）利用生物信息学大数据分析技术,对公共数据库中乳腺癌患者的临床资料进行生存分析,探究STAT5表达量和患者生存预后的关系。结果:（1）STAT5对HER2+乳腺癌形成的影响及其机制本研究成功构建STAT5过表达的MA小鼠原发HER2+乳腺癌模型,且发现STAT5过表达实验组乳腺癌生长明显快于对照组。STAT5过表达后,肿瘤组织中抗凋亡分子BCL-2及BCL-x L蛋白水平明显升高,证明STAT5通过抑制肿瘤细胞凋亡通路来促进乳腺癌形成。（2）STAT5对乳腺癌前病变及肿瘤组织功能分化程度的影响本研究成功取得STAT5过表达的HER2+癌前病变组织,及ER+和HER2+两种小鼠原发乳腺癌组织。STAT5过表达后,癌前病变、HER2+及ER+乳腺癌组织内,泌乳分化标志分子β-casein和PLIN-2蛋白表达量明显升高,所以STAT5能促进癌变组织发生功能性分化,降低其恶性程度,且这种促进作用从癌前病变阶段已经开始。（3）STAT5对乳腺癌转移风险的影响及其机制本研究成功构建STAT5过表达的人类乳腺癌细胞系MCF-7和MCF10A-PIK3CAH1047R,并发现STAT5过表达使这两种乳腺癌细胞系的体外侵袭和迁移能力显著减弱。动物模型研究显示,STAT5过表达可以明显降低小鼠原发HER2+乳腺癌模型肺转移率。同时,MCF10A-PIK3CAH1047R细胞成功在NSG小鼠乳导管内增殖形成癌灶,且STAT5过表达可以显著抑制癌细胞向远端器官转移。临床上,STAT5A转录水平高的乳腺癌患者预后较好,尤其是在ER+乳腺癌患者中,STAT5A高转录水平患者预后明显好于低转录水平患者。小鼠原发ER+乳腺癌组织的RPPA结果显示STAT5过表达使Vimentin和Slug的蛋白表达水平降低,提示乳腺癌细胞上皮间质转化过程受到抑制。Western blot和RT-q PCR验证了RPPA结果,STAT5过表达的小鼠ER+乳腺癌组织和MCF10A-PIK3CAH1047R细胞系,EMT相关标志分子表达水平发生改变,肿瘤细胞EMT过程受到了抑制。所以STAT5通过抑制乳腺癌细胞EMT过程降低转移风险。结论:（1）STAT5通过抑制乳腺癌细胞凋亡加快乳腺癌形成。（2）STAT5可以促进乳腺癌前病变和肿瘤组织发生功能性分化。（3）STAT5通过抑制乳腺癌细胞EMT过程降低肿瘤转移风险。（4）STAT5可以作为临床乳腺癌患者预后评估的生物标记物。