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龙牙百合是一种药食同源的重要经济作物,存在严重的连作障碍问题。目前已有研究表明,植物连作障碍是由土壤微生物种群结构的改变、土壤理化性质的劣化、植物病虫害的加重和化感自毒作用综合作用的结果。本文首次针对龙牙百合连作障碍,拟从龙牙百合的化感自毒作用的验证、龙牙百合化感自毒物质的分离和鉴定、分离获得的龙牙百合化感自毒物质活性的测定以及作用机制四方面进行研究。以期阐明化感自毒作用是龙牙百合连作障碍产生的原因之一,为有效治理龙牙百合连作障碍提供理论依据和实践基础。研究内容与结果如下:(1)龙牙百合化感自毒效应的研究以连作龙牙百合2年的土壤与购买未种植任何作物的全新营养土按照0:5(对照)、1:4、2:3、3:2、4:1和5:0的比例混配后对培养2个月的龙牙百合组培幼苗进行培育20d,结果显示,随着连作土壤比例的增加,龙牙百合组培幼苗叶绿素SPAD值逐渐降低,叶绿素SPAD值分别为:30.63、33.37、26.00、22.23、19.27和13.70;幼苗的苗高随着连作土壤比例的增加逐渐降低,苗高分别为5.90、8.60、5.87、4.74、3.90和3.07cm;根长随着连作土壤比例的增加逐渐变短,根长分别为2.53、4.17、2.23、1.87、1.73和0.80cm。表明连作龙牙百合的土壤中存在有抑制龙牙百合生长的物质,这种物质能使龙牙百合的叶绿素SPAD值降低、幼苗生长缓慢、根系发育不良;并且随着连作土壤含量的增加,这种抑制龙牙百合的生长物质越多,抑制作用越明显。此外,还观察到连作龙牙百合2年的土壤含量低时,对龙牙百合组培幼苗具有促进生长的作用,其表现在1:4时,叶绿素SPAD值、苗高及根长均大于未添加连作龙牙百合土壤的0:5对照。将龙牙百合成苗在营养培养液中培养10d、20d、30d,收集含有根系分泌物的营养液,研究其对黄瓜、白菜、水稻、萝卜和空心菜5种供试种子出芽及其根、茎的生长影响。结果表明,随着龙牙百合培养时间的增加,5种供试种子的出芽抑制率也随之增加,培养30d的龙牙百合根系分泌物培养液对水稻的出芽抑制率最高,达59.29%;龙牙百合根系分泌物对根具有明显地抑制生长作用,且随着龙牙百合培养时间的增加,抑制作用越强,培养30d的龙牙百合根系分泌物培养液对水稻的根长抑制率最高,达93.6%;龙牙百合根系分泌对茎的生长也有一定的影响,随着龙牙百合培养时间的增加,茎长抑制率也随之增加,培养30d的龙牙百合根系分泌物的培养液对黄瓜和空心菜的茎长抑制率最高,达73.15%。进一步表明,龙牙百合根系分泌物中存在着抑制植物生长的化感自毒物质。(2)龙牙百合化感自毒物质的分离与鉴定从田间生长10cm左右高的龙牙百合成苗,洗净根部土壤,放置营养液中培养30d,收集并获得含有龙牙百合根系分泌物的培养液,分别采用三氯甲烷(弱极性溶剂)、乙酸乙酯(中极性溶剂)、丙酮(极性溶剂)3种有机溶剂萃取和酸性氧化铝(酸性吸附剂)、中性氧化铝(碱性吸附剂)及XAD4离子交换大孔吸附树脂(中性吸附剂)3种色谱柱吸附层析的方法对龙牙百合根系分泌物进行分离,将采用以上6种方法分离得到的样品用GC-MS/MS(气质联用仪)鉴定,共获得3类化合物,一类是邻苯二甲酸酯类化合物,共25种;一类是酚酸类化合物,共6种;另一类是酰胺类物质,共1种,经过对谱库中标准物质的结构进行比对,确定为N,N-二乙基-二甲基苯甲酰胺。已有研究报道前两类物质邻苯二甲酸酯类和酚酸类是常见的化感自毒物质,但是鲜见关于N,N-二乙基-二甲基苯甲酰胺具有化感自毒作用的报道。(3)N,N-二乙基-二甲基苯甲酰胺化感自毒作用的活性测定购买N,N-二乙基-二甲基苯甲酰胺标准品,稀释成0.125、0.25、0.5、1、2和4mmol/L5个浓度,分别处理对小香葱(百合科,葱属)种子,观察N,N-二乙基-二甲基苯甲酰胺对种子出芽和根系保护酶活性影响,结果显示:?N,N-二乙基-二甲基苯甲酰胺处理后的小香葱种子出芽率随着浓度的增加表现降低的趋势。在0.125mmol/L的低浓度时,供试种子的出芽率最高,为97.87%,在4mmol/L的高浓度时,供试种子的出芽率为25.55%。?N,N-二乙基-二甲基苯甲酰胺处理后的植物根系保护酶超氧物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性随着N,N-二乙基-二甲基苯甲酰胺的浓度的增加表现出先增加后降低的趋势;过氧化物酶(POD)反之,随着N,N-二乙基-二甲基苯甲酰胺浓度的增加表现出先降低后增加的趋势;丙二醛(MDA)含量随着N,N-二乙基-二甲基苯甲酰胺浓度的增加表现出逐渐增加的趋势。研究结果表明,N,N-二乙基-二甲基苯甲酰胺有化感自毒的活性,不仅可以抑制种子的出芽,还可以降低植物根系保护酶的活性,增加有害物质丙二醛的含量,具有化感自毒作用。(4)N,N-二乙基-二甲基苯甲酰胺作用机制的初步研究以去离子水为对照处理(含有≦0.2%的甲醇),用N,N-二乙基-二甲基苯甲酰胺的标准品配制成1、2和3mmol/L的供试溶液,把龙牙百合放入供试溶液中进行培养,培养5d后取其根尖,采用番红固绿染色和透射电镜法观察龙牙百合的根尖结构。结果显示,与对照相比,N,N-二乙基-二甲基苯甲酰胺处理过的植物根尖的细胞,细胞液泡体积增加,细胞质浓缩,细胞核出现皱缩,细胞壁增厚,细胞发生严重变形,最终,细胞壁降解,细胞形成空腔。随着浓度的增加,N,N-二乙基-二甲基苯甲酰胺对根尖细胞结构的影响越严重。