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目的:甾醇调节元件结合蛋白裂解活化蛋白,又称SREBP裂解活化蛋白或SCAP,是一种由SCAP基因编码的人类蛋白。能够探测胞内胆固醇的水平,通过负反馈机制调节胆固醇摄取和内源性合成基因的表达水平来维持内环境胆固醇的稳态。SCAP主要与脂糖代谢及相关疾病有关,如非酒精性脂肪肝、主动脉粥样硬化。对于SCAP研究的不断扩展深入发现,SCAP的表达在细胞增殖、分化,胚胎发育等领域也有重要作用。本课题通过Cre-Loxp系统构建特异性敲除血管平滑肌SCAP基因的小鼠,试图探讨SM22-Cre小鼠特异性缺失SCAP基因对于胚胎血管平滑肌细胞增殖和发育的影响,并初步探讨其可能的分子机制。方法:1)体内实验:本研究选用的建模小鼠是平滑肌特异性表达Cre酶（SM22-Cre）和SCAPflox/flox转基因工具小鼠作为杂交繁殖对象。将雌性SCAPflox/flox小鼠与雄性SM22-Cre小鼠合笼交配繁殖,得到平滑肌特异性敲除SCAP基因小鼠杂合子(SM22-Cre;SCAPflox/+),剪取小鼠尾巴约5mm,提取尾DNA做定量PCR鉴定小鼠基因型,并用Western blot鉴定SCAP基因敲低的程度与特异性;再将雌雄SM22-Cre/SCAPflox/+小鼠交配繁殖,得到三种基因型子代小鼠,分别是SM22-Cre/SCAPflox/+,SM22-Cre/SCAPflox/flox,SM22-Cre/SCAP+/+,其中,基因型SM22-Cre/SCAPflox/flox为SCAP特异性敲除纯合子,基因型SM22-Cre/SCAPflox/+为SCAP特异性敲除杂合子,基因型SM22-Cre/SCAP+/+为野生型;于小鼠胚胎期E12.5、E14.5、E16.5d、E18.5d取小鼠胚胎,剪取胚胎后肢和尾部做定量PCR用于基因型鉴定,统计各基因型小鼠比例;在体视显微仪下观察子代小鼠胚胎大体形态发育,拍照记录;取野生型和SCAP纯合子小鼠(SM22-Cre/SCAP+/+;SM22-Cre/SCAPflox/flox)E14.5d胚胎连续切片,血管层面做IHC检测SCAP,观察SCAP特异性敲效果;连续切片做H.E.染色,观察血管壁厚度;免疫组化检测PCNA、PI3K、Akt等表达情况,观察血管增殖情况;2)体外实验:用不同浓度SCAP SiRNA转染VSMCs细胞,以检测VSMCs的SCAP基因干扰程度;在干扰了SCAP基因表达的VSMCs上检测检测细胞增值率;Western Blot检测血管平滑肌细胞干扰SCAP基因后SCAP,PCNA,PI3K,AKT蛋白水平的表达情况。结果:1.通过Cre/Loxp重组系统获得SM22-Cre;SCAPflox/+小鼠模型,经普通定量PCR检测SCAP mRNA表达量证明SCAP基因敲低,模型稳定可用,同时通过Wstern Blot检测小鼠主动脉、肝脏、肾脏的SCAP蛋白表达量,确认模型小鼠SCAP基因敲低的平滑肌特异性。2.模型小鼠交配繁殖,得到子代胚胎小鼠,发现SCAP敲除纯合子小鼠的出生率为零,仅有基因型为SM22-Cre/SCAPflox/+的杂合子和基因型为SM22-Cre/SCAP+/+的野生型小鼠出生。通过对小鼠不同胚胎时期的解剖发现,随时间推移,SCAP敲除纯合子逐渐降低,直至胚胎期E18.5天,纯合子下降为0。3.通过体视显微镜观察胚胎期E12.5、E14.5天小鼠胚胎,发现与野生型相比,SCAP敲除纯合子小鼠胚胎有明显血管出血,和发育延迟。4.小鼠胚胎连续切片,取血管层面做H.E染色,SCAP敲除纯合子较野生型比,其血管平滑肌细胞数量减少,血管壁厚度下降约50%;连续切片做免疫组化,SCAP敲除纯合子小鼠较野生型小鼠相比,SCAP,PCNA,PI3K,Akt表达量明显下降。5.不同浓度SCAP SiRNA干扰血管平滑肌细胞,用RT-PCR检测SCAP mRNA表达量,发现随SCAP SiRNA转染浓度的升高,SCAP mRNA表达量下降;细胞增殖率也随转染SCAP SiRNA浓度升高而下降。6.血管平滑肌细胞转染SCAP SiRNA后,用Wstern Blot检测SCAP、PCNA、PI3K、AKT、的表达量,SCAP干扰实验组较野生型相比,其表达量均明显下降。结论:SM22-Cre小鼠特异性敲除SCAP基因,抑制了依赖SCAP/SREBP调节的脂筏内胆固醇和脂肪酸的合成,从而抑制脂筏中PI3K/Akt信号通路的活化,导致特异性缺乏SCAP基因的血管平滑肌细胞增殖障碍,诱发胚胎血管壁变薄、胚胎内出血等可能是导致胚胎发育异常,并最终致死原因之一。