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异染色质蛋白HP1γ（Heterochromatin protein 1γ）是真核生物组成型异染色质的保守成分,由Cbx3基因编码。HP1γ通过影响组蛋白的表观遗传修饰参与基因的转录调控,从而影响细胞分化和生长等生物学过程。小鼠Cbx3缺失会导致雄性生殖细胞大量凋亡和精子发生受阻,雄性完全不育,雌性绝大多数不育。HP1γ在低等的脊椎动物特别是硬骨鱼类的研究鲜有报道。在尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）和黄鳝（Monopterus albus）中有报道cbx3在精巢和卵巢组织均有较高的表达,但具体的细胞表达类型和基因功能有待深入研究。由于硬骨鱼类特有的第三轮基因组复制,大多数硬骨鱼类中有两个编码HP1γ的基因,即cbx3a和cbx3b。本研究分析了cbx3a在不同发育阶段雌雄性腺中的表达模式和细胞表达类型,通过CRISPR/Cas9技术成功突变并获得了cbx3a纯合突变体,分析了性腺表型、基因表达和育性。主要研究结果如下:1、cbx3在罗非鱼性腺中的表达。转录组分析发现,cbx3a在孵化后5、30、90、180和300天（Days after hatching,dah）的罗非鱼雌雄性腺中均有表达。cbx3a在雌雄性腺中高表达,而cbx3b表达水平极低。本研究制备了尼罗罗非鱼Cbx3a多克隆抗体,并通过荧光免疫组化检测了其在5、30、90、180 dah尼罗罗非鱼性腺中的细胞表达类型。在雌鱼中,Cbx3a表达于不同发育阶段卵巢的卵原细胞和I-IV时相卵母细胞的细胞核,以及II-IV时相卵母细胞周围的颗粒细胞。在雄鱼中,Cbx3a特异表达于不同发育阶段精巢的生殖细胞的细胞核中,如精原细胞、初/次级精母细胞和精细胞。2、尼罗罗非鱼cbx3a突变系的建立。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术突变尼罗罗非鱼cbx3a基因,靶位点设计在第二个外显子上,将F0代阳性雄鱼与野生型（Wild type,WT）雌鱼交配获得缺失2 bp的F1代杂合突变体,再将该F1代雌雄突变体交配获得了F2代纯合突变体,并通过异源双链迁移实验（HMA）、Sanger测序,以及Western blot进行验证。3、cbx3a突变对卵子发生的影响。性腺组织学分析发现,在30 dah时,WT卵巢中的生殖细胞主要为卵原细胞和个别I时相卵母细胞,而cbx3a-/-卵巢中只有少量卵原细胞,不存在I时相卵母细胞;在90 dah时,WT卵巢中存在卵原细胞和较多的I、II时相卵母细胞;cbx3a-/-鱼卵巢表型出现了差异,5/14卵巢（Type I）发育情况与WT相似;9/14卵巢（Type II）明显小于WT,生殖细胞发育滞后,仅有大量卵原细胞。在180 dah时,WT卵巢中存在不同发育阶段的卵母细胞（I-IV）,cbx3a-/-Type I卵巢中同样存在各时相卵母细胞,其卵巢发育仍滞后于WT,但性腺成熟系数（Gonadosomatic index,GSI）与野生型无显著差异;而cbx3a-/-Type II卵巢中,存在大量卵原细胞和个别I时相卵母细胞,GSI显著降低于WT。对90、180 dah卵巢中卵泡数量进行统计分析发现,Type II卵巢中的卵原细胞数量显著高于、其它各时相卵母细胞数量显著低于WT。PCNA染色发现cbx3a-/-卵原细胞增殖显著增多。基因表达分析显示,cbx3a的突变导致细胞增殖、细胞周期、核糖体生物合成以及减数分裂恢复相关基因显著上调,而与细胞凋亡相关的溶酶体信号通路基因显著下调。4、cbx3a突变对精子发生的影响。90 dah时,性腺组织学分析发现WT精巢中存在不同发育阶段的生精细胞,精巢形态饱满。而cbx3a-/-精巢中出现不同程度的生殖细胞缺失,8/15精巢中存在少量精原细胞和精母细胞（Type I）,7/15精巢中仅存少量精原细胞（Type II）。在180 dah时,与WT相比,cbx3a-/-的精巢生殖细胞同样存在不同程度的退化,甚至完全缺失,并且精巢出现不同程度的水化、透明现象,精液浓度显著降低。精子活力分析显示,与WT相比,Type I的平均曲线速率（VCL）、平均直线速率（VSL）、前向运动精子比率（PR）等精子活力指标无显著变化,Type II显著降低;活细胞染料PKH26染色发现Type I的大部分精子畸形,尾部明显变短。2月龄的cbx3a-/-精巢转录组数据显示,与WT相比,神经活性配体-受体互作通路中与硬骨鱼生殖细胞减数分裂过程密切相关的trypsin基因显著下调。免疫组化结果显示,cbx3a-/-精巢中γH2AX和Sycp3的表达显著下调。TUNEL凋亡实验检测到cbx3a-/-精巢中存在大量凋亡的生殖细胞。综上所述,本研究表明Cbx3a在尼罗罗非鱼雌雄不同发育阶段生殖细胞的细胞核表达。利用CRISPR/Cas9技术成功突变并获得了cbx3a的纯合突变体。发现cbx3a纯合突变导致雌鱼卵原细胞增殖增加,减数分裂异常而停滞在卵原细胞阶段,雄鱼生殖细胞大量凋亡,甚至完全缺失。表明cbx3a对于罗非鱼生殖细胞的增殖、维持和发育具有重要作用。本研究深化和拓宽了异染色质蛋白在硬骨鱼类配子发生中作用的认知,也有助于深化对脊椎动物生殖发育调控的认识。