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冠心病最常表现为胸痛，但胸痛更常见于其他非心血管低危性疾病。疑诊为急性冠脉综合征(ACS)入院病例中，最终确诊ACS不到1／3。ACS是冠心病最常见发病形式，致死率高。目前临床早期评估ACS危险性依据包括：病史、心电图、心肌损伤标志物等。病史对于诊断特异性不高，有诊断意义的ECG在ACS患者中阳性率远不足50％，ST抬高仅见于40-50％急性心肌梗死患者，不稳定心绞痛患者则常常为阴性，尤其在胸痛缓解时。肌钙蛋白检测须在心肌坏死发生后8-12小时才达到理想的敏感性，而且对于不稳定性心绞痛(UA)敏感性较低。近年来研究认为外周血高敏感C-反应蛋白(hs-CRP)和B型利钠肽(BNP)是评价心血管事件发生的危险性指标。但hs-CRP受多因素的影响，如：急、慢性感染、肝损伤及其他炎症性疾病，而且检测方法未标准化，正常范围至今未确定。目前hs-CRP不被推荐临床常规检测。BNP用于心力衰竭诊断和预后评估已获广泛认同，但应用评估ACS危险性的临床价值，还需进一步论证。 动脉粥样硬化(AS)是一种慢性炎症性疾病，免疫反应在AS发生、发展中起重要作用。氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)是粥样斑块中主要的自身抗原，斑块细胞性成分主要为巨噬细胞(M_Φ)、T淋巴细胞及平滑肌细胞，其中T淋巴细胞特征性表达人白细胞抗原HLA-DR及分泌干扰素INF-γ；非细胞成分主要是OX-LDL和抗体。不稳定斑块中常出现更多的OX-LDL。 南京医科大学博士学位论文斑块T细胞特异性识别OX一LDL，斑块中杭体特异结合OX一LDL，提示针对Ox一LDL的免疫反应在斑块形成和发展中发挥重要作用。本研究旨在制备和筛选Ox一LDL单克隆抗体，建立双单杭检测OX一LDL方法，并应用于探讨胸痛患者冠脉危险性评估的价值。本研究分为以下四部分:一、抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体制备1 LDL纯化及OX一LDL制备 密度梯度超速离心法自人血浆分离LDL(l .019一1 .063留ml)，经琼脂糖、sDs一PAGE电泳并和标准品比较证实。LDL在20卿ol几cuso;存在条件下氧化2、4、8，卜时，制备OX一LDL，经琼脂糖电泳及SDS一PAGE电泳证实。2杭ox一LDL单克隆细胞株筛选 以蛋白定量75呵只的ox一LDL与等量完全福氏佐剂混匀，经腹腔免疫BALB/c小鼠，1月后同量杭原与等量不完全佐剂经腹腔加强免疫，间隔1月后重复1次。于再次加强后2周采用ELISA法检测血清滴度。融合前4天，以抗原1 50卿只，腹腔注射再次加强免疫。将脾细胞与骨髓瘤细胞(SPZ/0)融合，经HAT、HT选择性培养，获得杂交瘤细胞。约10天后，采用OX~LDL、LDL作杭原(包被液含0.27mmol几EDTA及40娜01几BHT)，ELIsA法筛选OX一LDL阳性且LDL阴性细胞株，3次融合筛选共得目的细胞株5株，分别是3B10、3E8、6Dll、2F9和2C9。3杭ox一LDL单克隆杭体扩大制备 上述5株杂交瘤细胞分别接种于多只经石蜡油预处理的BALB/c，卜鼠腹腔，收集腹水后，蛋白A纯化。westem blotting分析证实5株单克隆杭体仅与OX一LDL结合，与LDL不结合。 南京医科大学博士学位论文二、“双夹心”ELISA检测OX一LDL方法的建立 经两两配对比较实验，证实3BIO与6Dll为最佳配对之一。实验确定单抗3B10最佳包被浓度20林g/ml，辣根过氧化物酶(HRp)标记单杭6Dll最佳稀释度为1:500，据此建立“双夹心”ELISA方法。批间重复20次，批内重复14次，各浓度点批间及批内变异系数(CV)<10%，检测上限为400n留ml，下限为6.25n留ml。特异性比较显示:该检测系统主要与ox一LDL结合，而与LDL、人血清白蛋白、高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白及乏脂蛋白血浆(LPDP)结合较低。正常171例门诊体检人群，血浆稀释1:1000倍检测，血浆Ox一LDL水平为36.6士9.33u/m1。IU定义为相当参考标准ox一LDL蛋白定量1陀时所含氧化单位。正常参考值(95%可信限上界)小于54.71U/ml。三、外周血ox一LDL相关自身杭体检测方法的建立1丙二醛修饰的 LDL(MDA一LDL)合成 采用LDL与MDA，37℃反应3，卜时，经PBS充分透析后，添加终浓度为o.27mmol几的EnTA及40娜01几的B附，分装保存于一70℃，备用。2氧化磷脂修饰的LDL(OXPC一LDL)合成 P妙c暴露于空气氧化36小时，以终浓度Zmmol几与1 mg/ml的LDL，于37℃作用4小时，加NacNBH3 1 mg，经PBs充分透析后，添加终浓度为0.27~ol几的EDTA及40脚ol几的BHT，分装保存于一70℃，备用。3检测方法建立 杭原ox一LDL、MDA一LDL、OxPC一LDL及LDL均以2林留ml包被，1%BsA封闭，血清稀释101倍，显色抗体为HRp标记羊抗人IgG单克隆抗体， 南京医科大学博士学位论文以1:2000稀释，TMB为显色剂。经批内检测10次，批间检测14次，4种抗体检测CV值均<10%。四、抗氧化低密度脂蛋白单抗的临床应用与急性冠脉事件危险性评枯 方法:研究对象为因主诉胸痛或(和)胸闷入院的人群。分别来自南京市第一医院，南京市中大医院及江苏省人民医院，共309例，男202例，女107例。年龄63.4肚9