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中医“情志致病”学说在现代疾病病因中显示出重要的价值和意义。情志应激能通过打破内环境的稳定,引起机体对多种疾病的易感性。除了病毒自身的因素外,宿主是否处于“易感”状态对流感病毒感染的发生发展也有重要影响。线粒体抗病毒信号蛋白（Mitochondrial antiviral-signaling protein,MAVS）介导的IFNβ分泌是影响宿主感染RNA病毒的关键“易感”因素。本课题组前期研究发现拘束应激负荷及应激激素皮质酮（Corticosterone,CORT）能降低小鼠肺组织中MAVS的蛋白表达水平,减少IFNβ的分泌,进而增加小鼠对流感病毒的易感性,并且提示MAVS蛋白的减少可能与泛素化相关,但需要进一步深入研究。本课题采用小鼠拘束应激负荷及CORT负荷A549细胞建立的体内体外流感病毒易感模型,研究应激负荷诱发MAVS蛋白泛素化降解的机制,深入解析情志应激负荷条件下流感病毒易感性增加的生物学机制,完善中药药效评价模型体系,并为中药抗病毒机制研究提供新靶点。首先,采用拘束应激负荷小鼠与应激激素CORT负荷A549细胞分别建立体内及体外流感病毒易感模型。在体内模型中,Kunming小鼠随机分成4组:正常组、拘束应激组、病毒组、拘束应激病毒组（拘束应激+病毒）。拘束应激组和拘束应激病毒组的小鼠给予连续拘束应激负荷22 h,恢复3 d后鼻滴2×LD500 H1N1病毒,感染病毒5 d后取小鼠肺组织。qRT-PCR、Western blot及免疫组化结果显示,拘束应激负荷显著增加小鼠感染流感后肺组织中NP基因（p﹤0.001）和蛋白表达水平。采用TCID50检测小鼠肺组织中的病毒滴度,结果发现拘束应激病毒组中TCID50值显著高于病毒组（p﹤0.01）。肺组织切片H&E染色和Giemsa染色结果显示,拘束应激病毒组炎症浸润较病毒对照组加剧、炎症细胞明显增多、中性粒细胞及巨噬细胞数目增加。以上结果表明拘束应激增加了小鼠对流感病毒的易感性。在体外模型中,采用应激激素CORT（100μM）负荷A549细胞48 h后,给予10 TCID500 H1N1病毒吸附2 h,在培养箱中继续培养12 h。qRT-PCR、Western blot结果发现CORT能明显增加流感病毒感染后A549细胞中的NP基因（p﹤0.001）及蛋白表达水平,采用TCID50检测A549细胞中的病毒滴度发现CORT负荷病毒组中TCID50值显著高于病毒组（p﹤0.01）,采用免疫荧光结果显示NP蛋白表达较病毒对照组明显升高。以上实验及数据表明体内及体外流感病毒易感模型已成功建立。线粒体抗病毒蛋白MAVS介导的IFNβ分泌是宿主抵抗RNA病毒感染的重要途径。本课题进一步利用已建立的体内体外易感模型研究拘束应激/CORT影响MAVS/p-IRF3/IFNβ抗病毒信号通路的机制。Western blot结果显示拘束应激或CORT负荷明显抑制流感病毒引起的MAVS、p-IRF3及IFNβ蛋白表达增加。免疫荧光结果也证实了CORT负荷病毒组中MAVS表达明显降低。但是,qRT-PCR结果发现仅有IFNβ和p-IRF3基因表达受到抑制（p﹤0.01）,MAVS mRNA水平并不发生明显变化,提示MAVS的蛋白减少可能与其降解有关。为了进一步探讨MAVS蛋白的降解机制,我们采用蛋白合成抑制剂放线菌酮（Cycloheximide,CHX）和蛋白酶体抑制剂MG132在“CORT+Poly I:C（dsRNA类似物）”负荷A549细胞中进行实验,结果显示CHX显著加快MAVS的降解速率,而MG132（10μM,12 h）则增加MAVS的蛋白水平。另一方面,我们发现拘束应激或CORT均能增加病毒感染小鼠肺组织及A549细胞中的MAVS泛素化水平。因此,我们推断拘束应激/CORT引起的MAVS蛋白减少是通过泛素化降解途径实现。最后,我们研究和探讨了拘束应激/CORT引起MAVS泛素化的降解机制。RNA-sequence结果显示拘束应激或CORT能引起线粒体融合蛋白（Mitofusin2,Mfn2）明显上调,这一发现通过qPCR、Western blot及免疫荧光实验得以进一步证实。进一步我们发现A549细胞过表达Mfn2质粒（pCDNA3.1-Mfn2-Flag）能上调病毒感染后NP表达,且下调MAVS及IFNβ表达;si-Mfn2实验结果与Mfn2过表达实验结果相反。由此,我们推测Mfn2可能参与MAVS蛋白的泛素化降解机制中。Co-IP实验结果发现拘束应激或CORT均能增加病毒感染小鼠肺组织及A549细胞中的MAVS与Mfn2的相互作用,免疫荧光结果也显示MAVS与Mfn2的共定位明显增多。另一方面,我们发现Mfn2过表达能增加A549细胞中MAVS的泛素化且降低MAVS蛋白水平,si-Mfn2则得到相反的结果。为了进一步确证Mfn2参与了MAVS的泛素化,我们在HEK293T细胞中转染pCDNA3.1-MAVS-HA、pCDNA3.1-Mfn2-Flag、pCMV-UB-Myc质粒建立泛素化共转染系统,检测发现同时转染MAVS/Mfn2及UB质粒组中MAVS的泛素化程度明显强于未转染Mfn2的组别。最后,为了确定Mfn2促进MAVS泛素化的E3泛素蛋白连接酶,我们通过软件（Ubibrowser）预测找到了与MAVS泛素化相关评分最高（Score=0.736）的滑膜蛋白1（Synoviolin 1,SYVN1）。Co-IP实验结果显示,CORT显著促进病毒负荷A549细胞SYVN1与MAVS的相互作用。si-SYVN1显著降低MAVS的泛素化、增加MAVS及IFNβ表达且下降NP蛋白表达,但Mfn2蛋白无明显变化。以上多种实验技术手段及方法表明CORT引起Mfn2的增加,Mfn2募集E3连接酶SYVN1促进了MAVS的泛素化降解。综上所述,在本课题组前期研究的基础上,我们采用体内及体外流感病毒易感模型进一步阐明了情志应激诱发流感病毒易感性的生物学机制:CORT增加了Mfn2的表达,Mfn2募集E3连接酶SYVN1引发MAVS的泛素化降解,进而抑制了MAVS/p-IRF3/IFNβ抗病毒信号,促进病毒的复制,使机体对流感的易感性增加。本课题的研究结果丰富了情志致病中医理论,为评价中药药效及解析作用机制、寻找作用靶点提供了新的方向及角度。