【摘 要】
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研究背景卵巢癌是严重危害女性健康的常见妇科恶性肿瘤,其病死率位居女性生殖系统恶性肿瘤中的首位。肿瘤细胞减灭术联合化疗是治疗卵巢癌首选的方案,但患者会出现严重的化疗副作用或耐药现象,因此,寻找安全有效的抗肿瘤药物成为当今重要课题。随着中药及其有效成分治疗卵巢癌的优势在临床中日益突显,不仅可以特异性杀伤肿瘤细胞,而且对正常组织损伤较小,从中药中筛选安全有效的抗肿瘤药物已成为研究热点之一。莪术具有抗炎、
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研究背景卵巢癌是严重危害女性健康的常见妇科恶性肿瘤,其病死率位居女性生殖系统恶性肿瘤中的首位。肿瘤细胞减灭术联合化疗是治疗卵巢癌首选的方案,但患者会出现严重的化疗副作用或耐药现象,因此,寻找安全有效的抗肿瘤药物成为当今重要课题。随着中药及其有效成分治疗卵巢癌的优势在临床中日益突显,不仅可以特异性杀伤肿瘤细胞,而且对正常组织损伤较小,从中药中筛选安全有效的抗肿瘤药物已成为研究热点之一。莪术具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等功效。莪术醇作为莪术中的主要活性成分,在卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌等上皮性恶性肿瘤中表现出优越的抗肿瘤作用。然而,莪术醇具有难溶于水,易溶于有机溶剂,生物利用度低的缺点,容易限制药物的临床应用,为克服以上缺点,本课题组利用DSPE-PEG 2000为载体包载莪术醇,合成了莪术醇胶束（Micellar curcumol,MC）进行后续研究。在前期研究中,本课题组发现脂质体莪术醇通过PERK-e IF2α-Caspase3通路促进卵巢癌细胞凋亡,但莪术醇如何调控PERK基因转录目前尚不清楚。为进一步研究MC调控PERK基因转录的机制,通过NCBI查找到PERK基因的启动子区域,通过JASPAR网站（转录因子结合位点预测网站）,预测到PERK的启动子区域有转录因子FOXO3a的结合位点,并且通过文献检索,发现有研究报道FOXO3a可以结合PERK基因上游区域,促进PERK转录。结合文献和生物信息学预测,我们推测MC可能通过FOXO3a与PERK结合影响卵巢癌细胞凋亡,从而发挥抗癌效应。FOXO3a蛋白是叉头盒O（FOXO）转录因子的成员,调控广泛的生物过程,包括细胞增殖、细胞周期、代谢、凋亡、自噬、应激抗性和寿命。作为转录因子,FOXO3a可通过磷酸化等翻译后修饰调节其自身活性,发生亚细胞定位的改变。当FOXO3a发生磷酸化,FOXO3a从细胞核转移到细胞质,在胞质中与14-3-3蛋白结合,这种结合阻碍其重新进入细胞核导致其失活。相反,去磷酸化的FOXO3a会进入细胞核内,结合靶基因的启动子,直接调控基因的表达。目的:观察莪术醇胶束促进卵巢癌细胞凋亡的作用,探讨其通过FOXO3a-PERK通路促进卵巢癌细胞凋亡的可能机制。方法:收集卵巢癌组织标本,采用免疫组化和Western blot法检测卵巢组织中FOXO3a及p-FOXO3a的表达水平。选用卵巢癌细胞株SKOV3和OVCAR3,采用CCK8法检测不同浓度的MC对卵巢癌细胞增殖能力的影响;采用Western blot法检测MC处理前后两株癌细胞中FOXO3a蛋白表达水平;通过免疫荧光染色、核浆分离实验观察MC对FOXO3a亚细胞定位的影响;采用染色质免疫共沉淀检测MC对FOXO3a与PERK启动子结合能力的影响。利用si RNA敲低SKOV3和OVCAR3中FOXO3a表达,通过CCK8、流式细胞术观察卵巢癌细胞增殖和抗凋亡的改变以及MC作用后卵巢癌细胞增殖和抗凋亡的改变,并利用q PCR和Western blot检测MC作用前后PERK表达水平的变化。结果:1.MC呈浓度梯度依赖性地抑制卵巢癌细胞（SKOV3和OVCAR3）的活性（P＜0.05）。2.FOXO3a在人正常卵巢组织和卵巢交界性肿瘤中相对高表达,在卵巢恶性肿瘤中相对低表达（P＜0.05）。3.FOXO3a在正常卵巢上皮细胞株HOSEpic中相对高表达,在卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR3中相对低表达（P＜0.05）。4.MC处理卵巢癌细胞后,FOXO3a和PERK较对照组相比蛋白表达水平升高（P＜0.05）。5.MC处理卵巢癌细胞后,FOXO3a从细胞质向细胞核移位（P＜0.05）。6.MC处理卵巢癌细胞后,FOXO3a与PERK启动子区结合的能力增强。7.敲低FOXO3a后,MC处理的卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR3增殖能力增加,凋亡减少（P＜0.05）。8.敲低FOXO3a后,MC处理的卵巢癌细胞,其PERK的m RNA和蛋白表达水平下降。结论莪术醇胶束具有促进卵巢癌细胞凋亡的作用,它通过促进FOXO3a入核,增强其与PERK启动子区结合的能力,激活PERK通路是其可能的作用机制。
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