自20世纪初开始使用抗生素以来,人类医疗健康取得了前所未有的发展。但是随着抗生素在人类医学和畜牧业中的不合理应用,加速了细菌耐药性的产生和流行。黏菌素作为治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的“最后一道防线”,其地位尤为重要。但自2015年质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1首次被报道后,黏菌素耐药性问题引起了广泛关注,随后世界各地相继检出mcr-1,呈现全球流行趋势,这给多重耐药革兰氏阴性菌感染的治疗带来了巨大挑战。恢复药物敏感性可以显著改善治疗效果,但新药开发难度大,联合用药又存在交叉耐药、菌群失调等诸多弊端。因此,探索更加高效、特异的方法应对日益严重的细菌耐药性问题已经成为当前研究的热点。近些年,应用广泛的基因编辑技术CRISPR-Cas9有望成为减缓细菌耐药性问题的新手段。本论文旨在探究CRISPR-Cas9技术能否靶向消除大肠杆菌中Inc I2型的mcr-1阳性质粒,恢复其对黏菌素的敏感性并减少mcr-1基因的传播。本研究设计合成了两种不同长度（20 bp、30 bp）并靶向mcr-1基因的特异性sg RNA序列,将其分别克隆到p Cas9质粒上,同时构建了含高拷贝质粒p UC19-mcr-1或临床质粒p HNSHP45的耐药大肠杆菌,克隆成功的p Cas9质粒被转化到含mcr-1阳性质粒的大肠杆菌中并验证靶向消除效率。通过PCR和荧光定量PCR评估菌株中mcr-1基因的消除效率,微量肉汤稀释法检验消除前后菌株对黏菌素的耐药表型变化。结果显示,构建的CRISPR-Cas9系统可以有效消除大肠杆菌中携带mcr-1基因的质粒,针对临床耐药质粒,在选取的24个单克隆中消除率为75%,针对高拷贝耐药质粒,在选取的24个单克隆中消除率为100%;消除前后的菌株最小抑菌浓度由2μg/m L降为0.25μg/m L;对于高拷贝质粒p UC19-mcr-1,6小时即可达到50%的消除效率,而到8小时可达到80%的消除效率;并且sg RNA序列长度与消除效率没有显著相关性,反而质粒骨架结构是影响消除效率的重要因素。此外,通过体外接合实验分析证实,一旦细菌中含有靶向mcr-1基因的CRISPR-Cas9系统质粒,那么该系统就能够保护细菌免受携带mcr-1基因的质粒的水平转移。最后,对于实验中的脱靶现象,测序比对结果表明转入细菌中的CRISPR-Cas9系统发生了三种意想不到的突变,结构不再完整,导致该系统不能发挥作用,从而使少数耐药菌仍含有mcr-1基因。总之,本研究建立了一种单质粒介导的CRISPR-Cas9系统,能有效并特异性消除大肠杆菌的Inc I2型的mcr-1质粒,恢复其对黏菌素的敏感性,并且该系统的存在具有很大的潜力来抵抗外源mcr-1基因的水平传播。因此,CRISPR-Cas9系统能作为一种减缓和控制细菌耐药性传播的新型手段,但后续仍需要优化其递送方式以应用到临床治疗中。