猪卵母细胞来源及其体外成熟过程中添加体内成熟卵泡液或SDF1对其克隆胚胎发育的影响

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猪体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)技术在农业动物的育种与保种、拯救濒危动物、生物医学及医药上有着重要的应用价值。然而,当前SCNT猪的出生效率仅有1%左右。低克隆效率严重限制了猪SCNT技术的推广与应用。研究发现,SCNT胚胎的发育异常是由于其基因组不完全重编程导致的。在早期克隆胚胎的发育过程中,其基因组的重编程以及分化主要依赖卵母细胞在成熟过程储存的大量m RNA和蛋白质调控。因此,重编程能力强的卵母细胞是猪SCNT胚胎能否成功发育的重要因素。目前,猪的SCNT严重依赖卵母细胞的体外成熟(In vitro maturation,IVM)技术生产的体外成熟(In vitro matured,IVTM)卵母细胞,而体内成熟(In vivo matured,IVVM)的卵母细胞能否提高猪克隆效率仍然未知。此外,当前猪卵母细胞IVM培养液中普遍补充10%来源于屠宰场的未成熟卵泡的卵泡液(Slaughter house-derived immature follicle-derived fluid,IFF)。而IFF来源的卵巢,往往经过长时间的体外运输,频繁遭受到冷热应激降低其有益物质的丰度或累积对卵母细胞质量的负调控因子,降低卵母细胞体外成熟的效果。而且,IFF来源的卵泡,其生理状态仍然未向排卵期发育,导致IFF与体内成熟的卵泡液(In vivo-matured follicle-derived fluid,MFF)差异巨大。当前用MFF代替IFF添加到受体卵母细胞IVM培养液中能否提高猪克隆胚胎的发育效率也未知。如果能提高克隆胚胎的发育效率,则还需鉴定MFF中究竟是哪些因子起作用。因此,本研究的目的是,(1)比较体外、体内成熟的两种猪卵母细胞制备的克隆胚胎的体外发育效率;(2)比较体外成熟培养液中分别补充10%IFF和10%MFF对猪卵母细胞质量及其克隆胚胎体外发育效率的影响;(3)筛选鉴定MFF中对提高猪卵母细胞质量有重要作用的潜在因子,并探究在体外成熟培养液中补充该因子是否能提高体外成熟的猪卵母细胞质量及其克隆胚胎的体外发育。结果显示:(1)猪IVVM卵母细胞制备的克隆胚胎的体外发育效率显著高于IVTM组;(2)相较10%IFF,在IVM过程补充10%MFF能有效降低卵母细胞内ROS水平,上调卵母细胞质量相关基因的表达,提高IVTM卵母细胞制备SCNT胚胎的发育能力;PRM(Parallel reaction monitoring,PRM)结果发现,MFF中的FST显著低于IFF,而SDF1显著高于IFF;(3)在IVM培养液中补充20 ng/m L SDF1能显著提高卵母细胞的发育潜能,并降低卵母细胞ROS水平,提高卵母细胞内线粒体的潜能,促进卵母细胞质量相关、抗凋亡相关基因的表达,抑制促凋亡基因的表达。本研究证明体外成熟的猪卵母细胞支持克隆胚胎发育的潜能不如体内成熟的猪卵母细胞,并为猪卵母细胞的体外成熟培养提供了两个优化的IVM培养液方案,为提高体外成熟的猪卵母细胞的质量及其克隆胚胎的发育效率提供了支持。
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