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目的:视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞因其独特的解剖、生理功能在眼后段特别是维护视网膜神经细胞功能等方面有其重要的作用,同时RPE细胞独特的免疫功能因素对于维持视网膜功能的稳定、损伤反应和损伤后康复也有及其重要的作用.方法:1.人RPE细胞的培养、纯化和观察参照王雨生方法,对5只意外伤亡的尸供眼眼,12h内进行移去眼前段组织,制作眼杯,混合酶消化法分离RPE细胞,Fico11密度梯度分离纯化原代RPE细胞,酶消化同时处理人羊膜,RPE细胞接种到羊膜介质,进行模拟组织原原位的RPE细胞超微结构观察;用FITC标记的兔抗鼠IgG,抗HLA-DR单抗,PE标记或未标记的抗人FasL单抗,PE标记的抗人Fas单抗,进行免疫荧光双标记,通过FCM和激光共聚焦显微镜,观察FasL、Fas以及MHC class Ⅱ分子表达的水平及其相关性.2.制作正常眼组织以及PVR膜石蜡标本,进行三种免疫相关分子的免疫荧光染色,通过FCM或激光共聚焦显微镜观察三种分子的表达.3.通过经巩膜热凝、810nm激光经瞳孔温热治疗(TTT)、532nm激光视网膜光凝等方法建立兔RPE损伤模型,不同时间点对术眼进行眼底彩色照相、ERG、OCT、FA/ICGA等临床观察,对不同时间点兔眼后段组织进行组织病理学、超微结构和免疫荧光组织化学观察.4.设计CIITA启动子Ⅲ、Ⅳ和CIITA特异引物,通过RT-PCR,确定经IFN-γ诱导刺激下RPE细胞特异的CIITA启动子,通过CsA和FK506的抑制作用,观察RPE细胞CIITA的抑制表达以及三种免疫相关分子表达的相关性.结论:1.多种酶混合作用,消化分离原代RPE细胞,能较好地保存RPE细胞活性,有效形成RPE细胞单细胞悬液,细胞贴壁率和初步克隆形成率较单纯胰酶或联合EDTA消化结果高,密度梯度离心和不同速度离心结合方法纯化原代RPE细胞效果满意.国内文献未见相关报道.2.在IFN-gamma刺激下,RPE细胞在可诱导表达MHC clas s Ⅱ分子的同时,存在FasL的下调表达,而Fas表达没有明显改变.CsA和FK506分别抑制了部分MHC clas s Ⅱ分子的表达,抑制效果存在一定范围的时间和剂量的依赖性,联合用药未见明显的最大抑制效果出现.对于RPE细胞FasL的下调表达在国内外是首次报道.3.利用临床常见治疗措施分别制作兔RPE损伤模型,分别观察到在血-视网膜外屏障破坏后,RPE细胞存在MHCⅡ类分子的可诱导表达,以及FasL表达的改变,并且观察到经巩膜热凝诱导脉络膜新生血管形成.对于活体RPE细胞损伤检测具有重要意义.上述研究内容国内外属首次报道.4.RT-PCR确定性研究了RPE细胞特异性的CIITA启动子系CIITApⅣ型,FK506和CsA选择性抑制了CIITApⅣ活性,抑制了IFN-γ诱导的RPE细胞MHCⅡ类分子的表达,同时上调了FasL的表达.上述结果对于应用两种免疫抑制剂诱导体外RPE细胞免疫耐受具有重要意义,国内外研究未见类似报道.