【摘 要】
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目的:第一部分:探究改良的两血管阻塞法（2-VO）建立的血管性痴呆（VD）模型大鼠的损伤机制;第二部分:探究经皮穴位电刺激（TEAS）对VD大鼠认知的影响及其作用机制,为VD的临床治疗提供康复新技术和实验依据。方法:第一部分:24只雄性SD大鼠,随机分为对照组、模型组,每组12只。模型组采用改良的2-VO法建立VD大鼠模型。造模后,采用旷场实验、新物体识别实验观察大鼠的运动及学习记忆能力;采用RN
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目的:第一部分:探究改良的两血管阻塞法（2-VO）建立的血管性痴呆（VD）模型大鼠的损伤机制;第二部分:探究经皮穴位电刺激（TEAS）对VD大鼠认知的影响及其作用机制,为VD的临床治疗提供康复新技术和实验依据。方法:第一部分:24只雄性SD大鼠,随机分为对照组、模型组,每组12只。模型组采用改良的2-VO法建立VD大鼠模型。造模后,采用旷场实验、新物体识别实验观察大鼠的运动及学习记忆能力;采用RNA-seq技术筛选大鼠海马组织的差异表达基因（DEGs）,并采用GO功能注释和KEGG通路富集分析对其主要富集的功能和通路进行分析;采用qRT-PCR实验验证关键DEGs的m RNA转录水平。第二部分:36只雄性SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、TEAS组、电针组,每组9只。造模后,TEAS组和电针组均取大鼠百会穴和足三里穴,连续治疗14天,30分钟/次,每天1次。假手术组和模型组每天同样条件抓取和固定,但不治疗。治疗结束后,采用新物体识别实验、Morris水迷宫实验、Y迷宫实验观察大鼠的学习与记忆能力;采用HE染色观察大鼠海马区神经元形态结构;采用透射电镜观察大鼠海马区线粒体超微结构;采用ELISA试剂盒检测大鼠血清中氧化应激指标SOD,GSH-px,CAT的活性、MDA浓度以及ROS含量;采用Western Blot技术检测大鼠海马组织中PGC-1α,TFAM,HO-1,NQO1蛋白和细胞质中Keap1蛋白及细胞核中Nrf2,NRF1蛋白的表达。结果:第一部分:1.旷场实验结果:模型组大鼠在旷场中的自发运动行为和对周围环境的探索行为减少。2.新物体识别实验结果:模型组大鼠对新旧物体的识别系数低于对照组。3.RNA-seq结果:与对照组相比,VD大鼠海马组织的基因表达出现差异性,共筛选出195个DEGs,其中上调58个,下调137个。GO功能注释显示大多数DEGs参与细胞合成、生物调控以及神经系统发育过程。KEGG富集分析显示,有4个与VD相关的重要信号通路,分别是:ErbB信号通路、铁死亡通路、PI3K-Akt信号通路、Notch信号通路。4.qRT-PCR基因验证结果:富集于ErbB信号通路中和PI3K/Akt信号通路上Tgfα,ErbB3,Gab1,Cdkn1a,Creb5,Fgfr2,Col9a3的m RNA转录下降,而富集于铁死亡通路和Notch信号通路上Alox15,Pdzd2,Hes5的m RNA转录上升。第二部分:1.行为学实验结果:TEAS组及电针组大鼠治疗14天后,大鼠的逃避潜伏期降低,而识别系数、穿越原平台区域次数及原平台象限停留时间、交替百分数均较模型组提高;相比于电针组,TEAS组大鼠改善更明显。2.HE染色结果:模型组大鼠海马组织神经元数量减少,排列疏松、间隙增大、部分神经元形态不规则、核膜核仁边界不清、胞核固缩或溶解;与模型组相比,TEAS组及电针组大鼠海马神经元形态较规则、分布较均匀,核膜核仁较清楚,坏死神经元较少。3.透射电镜结果:模型组大鼠海马组织线粒体出现肿胀呈圆形、线粒体嵴溶解消失等超微结构病理改变;与模型组相比,TEAS组及电针组大鼠海马组织线粒体超微结构病理改变减轻,可见线粒体肿胀减轻,基质密度增高,线粒体嵴较明显。4.ELISA试剂盒检测结果:模型组大鼠血清中SOD,GSH-px及CAT的活性下降,而MDA浓度和ROS含量升高;与模型组相比,TEAS组及电针组大鼠血清中SOD,GSH-px及CAT的活性显著升高,MDA浓度和ROS含量降低。5.Western Blot技术检测结果:相比于模型组,TEAS组及电针组大鼠海马组织中的PGC-1α,TFAM,NQO1,HO-1蛋白和细胞核中Nrf2,NRF1蛋白表达升高,而细胞质中Keap1蛋白表达降低。结论:第一部分:本研究采用改良的2-VO法成功建立VD大鼠模型,并根据RNA-seq的结果推测VD模型大鼠的损伤机制可能是慢性低灌注状态导致保护海马神经元相关通路上的关键基因出现低转录,而诱导海马区氧化应激、炎症反应和凋亡等相关通路被激活,表现出学习与记忆能力下降。第二部分:TEAS通过上调VD大鼠海马组织PGC-1α,Nrf2,NRF1和TFAM蛋白的表达,启动抗氧化和线粒体生物发生机制,降低体内的氧化应激水平,减轻海马神经元和线粒体损伤,从而改善VD大鼠学习与记忆能力,且效果优于电针。
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