嗜水气单胞菌ZYAH131株噬菌体分离纯化及初步应用研究

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嗜水气单胞菌是水环境中常见的条件致病菌,感染宿主范围广,几乎所有大宗淡水养殖鱼类品种均能感染。草鱼感染后可引起肠炎、败血症等病症,对我国水产养殖造成严重损失,近年来其耐药性问题又给该菌的防控提出新挑战。噬菌体可以特异性地裂解细菌,具有繁殖快、专一性强、污染小等优点,具有成为抗生素替代制剂的潜力,本研究主要对嗜水气单胞菌草鱼分离株ZYAH131噬菌体进行分离、生物学特性、基因组测序以及初步应用展开研究,具体内容如下:对嗜水气单胞菌草鱼分离株ZYAH131进行多位点序列分析(MLST),依据gyr B、gro L、glt A、met G、pps A和rec A六个管家基因序列结果判定ZYAH131株为ST517型。以ZYAH131为宿主菌,从黑龙江哈尔滨、安徽合肥、湖北武汉、四川成都、贵州贵阳、浙江宁波、广东广州、广西桂林、内蒙呼伦贝尔九个省市自治区采集样品158份进行噬菌体筛选,共分离获得噬菌体24株,命名为ZPAH127-ZPAH150。裂解曲线结果显示24株嗜水气单胞菌噬菌体在一定时间内都可以抑制嗜水气单胞菌ZYAH131株的生长,具有良好的裂解活性,其中噬菌体ZPAH132和ZPAH140抑菌时间最长,裂解活性最强。噬菌体ZPAH132和ZPAH140均属于裂解性噬菌体,在双层琼脂出现圆形透亮噬菌斑,大小规则。透射电镜观察显示噬菌体ZPAH132和ZPAH140均有尾,具有正二十面体头部,属有尾噬菌体目。噬菌体ZPAH132和ZPAH140温度耐受性良好,30℃-60℃温度区间内能保持稳定滴度。ZPAH132在p H 4-10之间滴度稳定,而ZPAH140的p H耐受区间更为宽泛,为p H 4-11。在最佳感染复数(MOI=0.001)下,噬菌体ZPAH132 15 min吸附率为98.85%。生长曲线结果表明噬菌体ZPAH132潜伏时长为25 min,生长时长为50 min,平稳期效价为1010PFU/m L。在最佳感染复数(MOI=0.1)下,噬菌体ZPAH140的10 min吸附率为90.77%。生长曲线结果表明ZPAH140潜伏时长为25 min,生长时长为25 min,平稳期效价为10~9PFU/m L。上述两株噬菌体均表现出潜伏期短,平台期滴度高,裂解能力强的特点。全基因组测序结果表明:ZPAH132基因组大小53.340 kb,G/C含量52.3%,共有69个开放阅读框(Open reading frame,ORF);ZPAH140基因组大小52.412 kb,G/C含量46.9%。共有64个ORF,上述基因组中均未发现毒力基因和抗生素耐药基因。草鱼防治试验中,对于嗜水气单胞菌ZYAH131株的感染,ZPAH132能够提供50%预防和62.5%治疗效果,而ZPAH140则能提供50%预防和50%治疗效果。综上,噬菌体ZPAH132和ZPAH140裂解能力强,潜在风险小,对于嗜水气单胞菌的感染具有一定的保护效果。本研究结果为嗜水气单胞菌的生物防控新策略的开发提供了科学依据。
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