随着缺血性心肌病发病率的逐年增加,随之而来的缺血再灌注损伤问题引发了临床医师的高度关注。线粒体损伤和随后的铁死亡是心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI）的主要原因。MIRI已成为缺血性心肌病患者预后不良的重要原因。到目前为止,MIRI的机制仍然未知,也没有有效的治疗方法。因此,阐明其发病机制和开发潜在的治疗靶点具有重要意义。Sirtuin1（SIRT1）和Sirtuin3（SIRT3）是沉默信息调节器2（SIR2）蛋白家族的两个充分表征的成员。SIRT1和SIRT3都已被证明在保护心肌细胞抵抗MIRI中发挥重要作用,但过去针对SIRT1和SIRT3与MIRI的关系开展的研究多集中在这两者之一的单基因层面,而关于两者间的协作关系则鲜有报道。本研究旨在探讨SIRT1与SIRT3的内在联系及其在MIRI过程中与线粒体自噬相关铁死亡的关系。我们通过生物信息学分析的方法结合细胞实验发现SIRT1与SIRT3在心肌细胞缺血再灌注损伤过程中表达异常,两者存在表达上的相互抑制,且两者形成了具有内在联系的调控轴,该轴可通过PINK1/Parkin信号通路调控缺血再灌注损伤心肌细胞中线粒体自噬的动态平衡,以此来调控细胞铁死亡过程,保护心肌细胞抵抗因缺血再灌注造成的损伤。因此,本研究对SIRT1及SIRT3在MIRI中的角色定位有了些新的发现及看法,可为缺血性心肌病患者防治缺血再灌注损伤提供潜在的治疗靶点。第一部分:SIRT1/SIRT3在缺血性心肌病中的表达及其表达相关性分析背景:目前的研究中,SIRT1/SIRT3在缺血性心肌病患者缺血再灌注损伤过程中的表达情况不明确且存在不少矛盾的地方;另外,SIRT1/SIRT3在心肌细胞缺血再灌注损伤过程中是否存在协同作用也不明确。目的:从基因层面探讨SIRT1/SIRT3在缺血性心肌病患者心肌组织和外周血中的表达及其相关性,并通过细胞实验从分子水平验证所分析的结果,初步分析SIRT1/SIRT3在缺血性心肌病缺血再灌注损伤发生发展中的作用。方法:我们首先利用R软件中“merge”函数合并来自基因表达综合数据库（Gene expression omnibus,GEO）中的缺血性心肌病患者的心肌组织样品数据集GSE5406,GSE1869及GSE974;同样方法合并来自GEO数据库中的缺血性心肌病患者的外周血样品数据集GSE48060及GSE97320;“Combat”函数去除批次效应以后,提取SIRT1及SIRT3表达数据矩阵,利用R软件中“ggboxplot”可视化基因表达结果;“ggscatter”可视化表达相关性结果。随后,通过体外构建细胞缺氧/复氧（Hypoxia/reoxygenation,H/R）损伤模型,结合基因敲除技术验证SIRT1/SIRT3表达及其表达相关性,从而明确SIRT1与SIRT3的内在联系,并证实SIRT1-SIRT3轴的存在。结果:SIRT1表达在缺血性心肌病患者心肌组织及外周血中均低于对照组（P＜0.05）,而SIRT3在两组中无明显差异。SIRT1与SIRT3表达在在缺血性心肌病患者心肌组织及外周血中均呈显著负相关（P＜0.001）。体外细胞H/R模型验证了上述结果,发现SIRT1在H/R组中表达显著低于对照组（P＜0.05）,而SIRT3在两组中表达无明显变化。有趣的是,sh SIRT3组中SIRT1表达显著增加,且sh SIRT1+sh SIRT3组SIRT1表达也显著高于sh SIRT1组中表达（P＜0.05）;更为有趣的是,sh SIRT1组SIRT3表达也显著增加,且sh SIRT1+sh SIRT3组SIRT3表达也显著高于sh SIRT3组中表达（P＜0.05）。结论:SIRT1及SIRT3在缺血性心肌病患者中表达异常,且两者形成了具有表达上相互抑制的调控轴,通过该轴参与了心肌细胞缺血再灌注损伤的发生发展。第二部分:SIRT1-SIRT3轴的异常通过铁死亡促进MIRI的发生发展背景:心肌细胞缺血再灌注损伤的过程伴随着铁死亡的发生。线粒体损伤及随后的铁死亡是心肌细胞缺血再灌注损伤的主要原因。在前面的生物信息学分析过程中,我们发现SIRT1-SIRT3轴表达改变会引起铁死亡相关基因的表达改变,因此,我们推测SIRT1-SIRT3轴与铁死亡存在着关联,可能参与了铁死亡的调控,进而参与MIRI的发生发展。目的:本部分实验拟研究SIRT1-SIRT3轴与缺血再灌注损伤过程中心肌细胞铁死亡的关系及其对铁死亡的具体影响。方法:我们首先从公共数据集GEO116250中提取铁死亡相关基因的表达矩阵,经表达差异分析后,用最小绝对收缩和选择算子（Least absolute shrinkage and selection operator,LASSO）算法提取核心差异基因,最后对SIRT1/SIRT3与这些核心铁死亡相关差异基因的相关性进行分析从基因层面初步评估SIRT1/SIRT3与铁死亡的相关性。随后,我们通过细胞模型实验验证上述生物信息学分析结果并在此基础上进一步探讨SIRT1/SIRT3对心肌细胞铁死亡的具体影响。应用基因敲除技术下调H9c2细胞中SIRT1及SIRT3蛋白的表达并经H/R损伤处理后,应用Fe2+检测试剂盒检测Fe2+浓度变化;丙二醛（Malondialdehyde,MDA）法检测MDA含量变化;JC-1线粒体膜电位检测试剂盒检测线粒体损伤程度。结果:我们从GEO116250数据集中提取了218个与铁死亡相关的基因微阵列数据,经过差异表达分析,提取出了15个差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）,其中8个上调表达基因,7个下调表达基因;接着,用LASSO算法进一步提取出了3个铁死亡相关的核心差异基因。经相关性分析发现,SIRT1/SIRT3与这3个核心差异基因密切相关（P＜0.05）。随后,我们用基因敲除技术敲除H9c2细胞系中SIRT1和SIRT3蛋白的表达并经H/R处理后,我们发现SIRT1及SIRT3干扰组中Fe2+浓度、MDA含量及线粒体受损比例均明显增加（P＜0.05）,但是SIRT1干扰组与SIRT3干扰组相比,上述表征并不具有统计学差异。结论:SIRT1-SIRT3轴与缺血再灌注损伤心肌细胞铁死亡密切相关;SIRT1-SIRT3轴表达沉默会引起心肌细胞铁死亡发生率显著增加,因此,SIRT1-SIRT3轴的表达异常通过铁死亡促进心肌细胞缺血再灌注损伤的发生发展;此外,本部分表征还进一步证实SIRT1与SIRT3形成的是一种既有相互抑制且又缺一不可的调控轴。第三部分:SIRT1-SIRT3轴通过PINK1/Parkin信号通路调控心肌细胞的铁死亡过程背景:线粒体自噬平衡的破坏会导致细胞铁死亡增加,以往的研究表明SIRT1及SIRT3均与自噬密切相关,因此,我们推断SIRT1-SIRT3轴是通过调控线粒体自噬的动态平衡来调控心肌细胞铁死亡的发生的。目的:本部分我们拟进一步深入研究SIRT1-SIRT3轴调控缺血再灌注损伤心肌细胞铁死亡的具体机制及其调控信号通路。方法:我们从公共数据集GEO116250中提取线粒体自噬相关的基因微阵列数据,经相关性分析后,找出与SIRT1/SIRT3密切相关的基因,随后应用细胞模型加以验证并深入探讨。在实验验证部分,我们应用基因敲除技术沉默H9c2细胞中SIRT1及SIRT3蛋白的表达后,用Western Blotting检测线粒体自噬相关蛋白的表达变化以验证生物信息学分析结果。最后从这些自噬相关蛋白中挑取其中的关键分子,敲除其表达后观察细胞铁死亡相关表型的变化以验证该信号通路,并观察SIRT1的激动剂白藜芦醇（Resveratrol,Res）和/或SIRT3的激动剂和厚朴酚（Honokiol,HKL）能否逆转该关键分子表达沉默造成的影响。结果:我们发现SIRT1-SIRT3轴基因表达的改变伴随着PINK1/Parkin信号通路基因中PINK1,Parkin,LC3及P62/SQSTM1表达的改变,该结果得到了体外细胞模型实验验证。在H9c2细胞株中敲低PINK1蛋白表达后,细胞出现了与SIRT1-SIRT3轴表达沉默一致的铁死亡表征:Fe2+浓度增加、MDA含量增加及线粒体受损比例增加等现象（P＜0.05）,而Res及HKL均可有效逆转上述改变（P＜0.05）。结论:SIRT1-SIRT3轴通过PINK1/Parkin信号通路调控线粒体自噬的动态平衡进而调控心肌细胞的铁死亡过程;SIRT1-SIRT3轴的表达异常通过线粒体自噬依赖性的铁死亡促进MIRI的发生发展。