EPO通过Akt通路促进胶质母细胞瘤体外快速增殖的作用研究

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目的本研究拟通过胶质母细胞瘤的体外实验,研究促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是否存在促进胶质母细胞瘤快速增殖的作用,并探讨AKT信号通路和细胞周期关键蛋白CyclinD1表达的调节是否为其关键的作用靶点。方法本研究采用胶质母细胞瘤U87细胞株,在体外成功培养后分为对照组、EPO处理组及EPO+蛋白激酶B(Protein Kinase B,Akt)抑制剂组。EPO处理组:在U87细胞的培养基中加入EPO(0.1U/ml)处理7天;对照组:用等体积PBS替代EPO;EPO+Akt抑制剂组:U87细胞的培养基中同时加入EPO(0.1U/ml)及Akt抑制剂(81.3μM)共处理7天。采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法测生长曲线、细胞倍增时间和克隆形成检测各组细胞增殖速度,通过以上检测EPO对胶质母细胞瘤U87细胞株增殖的影响;采用反转录聚合酶链反应PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)、蛋白质印迹(Western blotting,WB)和细胞免疫荧光法(immunofluorescence,IF)测定CyclinD1的mRNA和蛋白质表达变化,通过以上检测EPO对胶质母细胞瘤中细胞周期关键蛋白CyclinD1表达的影响;采用流式细胞仪检测EPO对胶质母细胞瘤U87细胞株细胞增殖周期的影响。结果与对照组相比,EPO处理组中U87细胞生长速度明显增快(P生长曲线3天/5天/7天=0.020/0.028/0.007,P倍增时间=0.0269,P克隆形成=0.0010),细胞中CyclinD1 mRNA及蛋白的表达水平均较对照组明显升高(PRT-PCR=0.0186,P P-Akt=0.0020,Pβ-Cantenin=0.0026,P CyclinD1=0.0022,PIF=0.0099),流式细胞仪检测发现U87细胞的增殖指数也明显升高(P=0.0028);与EPO处理组相比,EPO+Akt抑制剂组细胞CyclinD1 mRNA及蛋白的表达水平明显降低(PRT-PCR=0.0029,P P-Akt<0.0001,Pβ-Cantenin=0.0003,P CyclinD1<0.0001,PIF=0.0007),细胞增殖指数则有显著下降(P=0.0036),同时细胞增殖能力和速度较EPO处理组显著降低(P生长曲线3天/5天/7天=0.000/0.001/0.000,P倍增时间=0.0010,P克隆形成=0.0017)。结论本研究发现EPO可显著促进胶质母细胞瘤的体外增殖,上调细胞周期关键蛋白CyclinD1的表达,加快细胞增殖周期可能是重要的分子机制。
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