应激是机体在应对生存环境多种不利因素过程中,认知或实际上的需求与应对能力之间不平衡所导致的机体的心理生理紧张状态及其反应。长期的高应激负荷可导致心功能紊乱、高血压、动脉粥样硬化等多种严重心血管疾病的发生。心肌细胞凋亡是心肌损伤发生的重要细胞学基础之一,Fas信号通路是心肌细胞凋亡的重要途径。前期研究发现HSP70可阻抑Fas通路的活化以减缓应激所致心肌细胞凋亡的发生,但对其分子机制尚不清楚。FAF1(Fas-associated factor-1)作为死亡诱导信号复合物(death inducing signaling complex,DISC)的重要组成部分,对于Fas通路活化具有重要的调控作用,被称为Fas通路的重要调控元件。对FAF1分子结构的分析表明,HSP70、Fas与FAF1的结合位点存在着明显的重叠区,在FAF1分子的82-180氨基酸区域,HSP70、Fas与FAF1结合域甚至完全相同,提示了HSP70、Fas在与FAF1的结合中存在着相互竞争性抑制的可能性。因此,认识应激心肌细胞中FAF1表达水平的变化规律及其对应激心肌细胞凋亡Fas通路的影响,揭示FAF1在HSP70阻抑应激心肌细胞凋亡Fas通路中的节点调控作用,认识FAF1与HSP70相互作用对Fas-FAF1相互作用及DISC形成的影响,发现FAF1在HSP70阻抑应激心肌细胞凋亡Fas通路中生物学作用的分子基础,有助于阐明应激致心肌细胞凋亡的生物学基础,对于HSP70阻抑应激致心肌细胞凋亡机制的研究,有助于探索和发现防治应激致心血管损伤的新的医学途径。一、应激致心肌细胞凋亡模型中FAF1的表达规律结合本实验室前期研究,选取180-200g Wistar大鼠以间歇式束缚应激模式诱导应激动物模型建立,应用本实验室研制的大鼠束缚舱对大鼠进行每天6h的束缚应激,三个应激组大鼠束缚应激持续时间为1w、2w和3w,对照组大鼠不进行束缚应激。建模完成后,应激2w和3w组大鼠血浆中糖皮质激素(glucocorticoid,GC)和去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)水平较对照组显著升高;心肌组织TUNEL染色显示,应激组大鼠心肌组织中细胞凋亡率较对照组显著升高,表明束缚应激致大鼠心肌损伤模型成功建立。采用western blot检测应激致心肌细胞凋亡的动物模型中心肌组织FAF1的表达水平,可见FAF1水平随束缚应激时间的增长而逐渐升高,并与应激心肌细胞的凋亡率具有明确的相关性规律。依据束缚应激大鼠血浆NE水平,分别对四组H9c2细胞给予0μM,5μM,20μM,50μM NE干预36h,构建应激致心肌细胞凋亡的细胞模型,通过流式细胞术检测不同剂量NE干预下H9c2细胞的凋亡率。结果显示,NE可诱导H9c2细胞的凋亡,且存在剂量效应关系,应激致心肌细胞凋亡模型构建成功。采用western blot检测应激细胞中FAF1的表达水平,FAF1表达水平随NE浓度的增加而逐渐升高,与应激细胞的凋亡率也存在相关性。二、FAF1在应激心肌细胞凋亡中的生物学功能在应激心肌细胞凋亡模型中,采用western blot检测FAS蛋白表达水平,采用caspase-8活性检测试剂盒检测NE作用下H9c2细胞中caspase-8的活性水平,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示,NE可显著升高细胞中的FAS表达水平,且caspase-8活性亦显著升高,提示应激心肌细胞中Fas通路的活化。构建并转染FAF1高表达载体,调控心肌细胞中FAF1表达水平升高;设计并合成了FAF1的si RNA,特异性敲低细胞FAF1表达水平,观察不同FAF1表达水平对细胞FAS通路活化状态和细胞凋亡水平影响。研究结果显示,在50μM NE诱导的应激心肌细胞中,FAF1的高表达可诱导心肌细胞中caspase-8活性和细胞凋亡率显著升高;而si RNA抑制FAF1表达后,caspase-8活性和细胞凋亡率明显下降。心肌细胞FAF1水平与细胞caspase-8活性和细胞凋亡率存在正相关关系,表明了FAF1在心肌细胞中发挥促凋亡的作用。三、HSP70在应激致心肌细胞凋亡进程中的调控作用构建HSP70高表达载体并转染H9c2细胞,调控细胞内HSP70高表达;应用热休克蛋白抑制剂KNK437阻抑H9c2细胞内HSP70表达;分别给予上述HSP70高表达或表达抑制的H9c2细胞以50μM NE干预36h,建立不同HSP70水平的应激心肌细胞模型。应用western blot检测细胞中FAS水平,应用caspase-8活性检测试剂盒检测caspase-8活性,研究HSP70表达水平对应激心肌细胞凋亡的影响。结果表明,高表达HSP70能降低细胞中FAS表达水平,并继而降低caspase-8活性;抑制HSP70表达水平,则引起FAS表达水平和caspase-8活性水平的升高。提示HSP70对应激所致心肌细胞凋亡Fas通路的激活具有明显的抑制作用,从而降低应激所导致的心肌细胞凋亡,对心肌细胞产生重要的保护作用。四、FAF1在HSP70阻抑心肌细胞凋亡Fas通路中的生物学作用及其机制采用免疫共沉淀技术检测H9c2细胞中HSP70、FAF1及FAS的相互作用。结果表明,HSP70与FAF1之间、FAS与FAF1之间均存在相互作用。构建HSP70全长序列高表达载体p EGFP-r HSP70和HSP70 N末端1-120位氨基酸缺失的突变体p EGFP-N1/r Hsp70△N-(121–642),转染至H9c2细胞后,采用免疫共沉淀技术检测HSP70与FAF1之间的相互作用,结果显示,N末端1-120位氨基酸缺失的HSP70突变体不再与FAF1产生相互作用,表明HSP70与FAF1的作用区域是位于HSP70 N末端的1-120位氨基酸区域。在H9c2细胞中转染HSP70全长序列高表达载体,调控细胞内HSP70高表达,采用免疫共沉淀技术检测FAS与FAF1的相互作用。研究结果表明,与对照组相比,高表达HSP70的细胞中,与FAS相互作用的FAF1水平降低,细胞中Fas通路活化水平下降。HSP70的表达水平对FAS-FAF1相互作用及DISC形成具有重要影响,对应激心肌细胞的凋亡具有重要的调节作用。在50μM NE干预的H9c2细胞中,分别转染HSP70全长序列高表达载体和HSP70 N末端1-120位氨基酸缺失的突变体,采用caspase-8活性检测试剂盒检测H9c2细胞中caspase-8的活性水平,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示,转染全长序列HSP70高表达载体可显著缓解NE引起的细胞caspase-8活性的升高和细胞凋亡率的升高,而转染HSP70 N末端1-120位氨基酸缺失突变体的细胞中,NE引起的caspase-8活性的升高和细胞凋亡率的升高未见明显降低。这表明FAF1与HSP70之间的相互作用可影响Fas通路的活化程度,与HSP70对应激心肌细胞的保护作用密切相关。综上所述,本研究在动物和细胞水平上系统研究了应激心肌细胞FAF1在HSP70对应激心肌细胞保护机制中的生物学作用及其分子机制。研究结果表明,应激状态下,心肌细胞中FAF1高表达,并进一步促进心肌细胞Fas通路的活化,诱导细胞凋亡。HSP70通过与FAS竞争性结合FAF1,弱化了FAF1和FAS的相互作用,阻抑了DISC的形成,抑制了caspase-8活化所介导Fas通路的活化,对应激心肌细胞凋亡通路具有重要的节点调控作用。FAF1是HSP70阻抑应激心肌细胞凋亡Fas通路的重要作用靶点。本研究结果揭示了HSP70对应激心肌细胞保护作用的重要分子机制,这对于阐明心肌细胞应激的生物学基础、探索HSP70抑制应激心肌细胞凋亡的机制、开拓防治应激致心血管损伤的新的医学途径具有重要的现实意义。