【摘 要】
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目的:评价L型电压依赖性钙通道α1亚基在肝癌患者中的表达及预后,通过观察硝苯地平对肝癌细胞Huh-7的作用,研究硝苯地平对Huh-7细胞生长、自噬小体形成的影响,初步探明硝苯地平促进Huh-7细胞自噬小体形成的可能分子机制。方法:通过癌症基因组图谱（TCGA）中肝癌患者相关数据,分析L型电压依赖性钙通道α1亚基在肝癌患者中的表达及预后;通过RNA测序技术（RNA-seq）检测L型电压依赖性钙通道α
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目的:评价L型电压依赖性钙通道α1亚基在肝癌患者中的表达及预后,通过观察硝苯地平对肝癌细胞Huh-7的作用,研究硝苯地平对Huh-7细胞生长、自噬小体形成的影响,初步探明硝苯地平促进Huh-7细胞自噬小体形成的可能分子机制。方法:通过癌症基因组图谱（TCGA）中肝癌患者相关数据,分析L型电压依赖性钙通道α1亚基在肝癌患者中的表达及预后;通过RNA测序技术（RNA-seq）检测L型电压依赖性钙通道α1亚基在肝癌细胞及正常肝细胞中的表达情况;以不同浓度的硝苯地平体外干预肝癌细胞Hep G2、SK-Hep1和Huh-7,检测其IC50;采用细胞增殖实验（CCK-8）和克隆形成实验,检测硝苯地平对Huh-7细胞增殖的影响;通过流式细胞术,检测硝苯地平对Huh-7细胞周期的影响;进行裸鼠皮下成瘤实验,检测硝苯地平对人肝癌细胞成瘤的影响;运用激光共聚焦显微成像技术,观测硝苯地平对Huh-7细胞自噬小体形成的作用;Western blot实验检测细胞自噬相关蛋白Atg3、Atg5、Atg7、LC3B、Beclin1及p-Beclin1-S93的表达变化。结果:TCGA肝癌数据库中分析显示,L型电压依赖性钙通道α1亚基在肝癌及相应癌旁组织中均有表达,其中CACNA1C、CACNA1F、CACNA1S在肝癌中的表达明显高于相应的癌旁组织,差异具有统计学意义,CACNA1D在肝癌及相应癌旁组织中的表达无明显差异;另外,CACNA1C、CACNA1S表达的高低与肝癌患者的预后相关,CACNA1C在肝癌中高表达时患者预后好,CACNA1S低表达时患者预后好;L型电压依赖性钙通道α1亚基在肝癌细胞（Huh-7、HCCLM3、Hep G2、SK-Hep1）和正常肝细胞L02中的表达各不相同,其中,CACNA1C在Hep G2和SK-Hep1细胞中表达,CACNA1D在Huh-7、HCCLM3、Hep G2和L02细胞中表达,CACNA1F在Hep G2、SK-Hep1和L02细胞中表达,CACNA1S只在L02细胞中表达;CCK-8实验检测结果表明,48 h时硝苯地平对Hep G2、SK-Hep1和Huh-7细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为36.7 mg·L-1、39.7 mg·L-1、30.5 mg·L-1,硝苯地平可明显抑制Huh-7细胞的增殖,并呈时间和浓度依赖关系;克隆形成实验结果表明,浓度为25 mg·L-1的硝苯地平作用使Huh-7细胞的克隆形成率较对照组显著降低,克隆形成的抑制率结果为（95.46±0.45）%;流式细胞术周期检测结果提示,硝苯地平将Huh-7细胞周期阻滞于G1期;裸鼠皮下成瘤实验结果显示,硝苯地平组瘤重明显低于对照组瘤重,硝苯地平抑制裸鼠皮下瘤的生长;激光共聚焦显微镜影像结果显示,硝苯地平可以促进GFP-LC3B的聚集,提示硝苯地平明显诱导Huh-7细胞自噬小体形成;Western blot结果分析提示,硝苯地平显著上调LC3B-II、Beclin1、p-Beclin1-S93蛋白表达水平。结论:1.L型电压依赖性钙通道α1亚基CACNA1C、CACNA1F、CACNA1S在肝癌及相应癌旁组织中的表达具有差异性。2.L型电压依赖性钙通道α1亚基CACNA1C的表达与肝癌患者的预后呈正相关,CACNA1S的表达与肝癌患者的预后呈负相关。3.L型钙通道阻滞剂硝苯地平明显抑制肝癌细胞Huh-7生长。4.L型钙通道阻滞剂硝苯地平促进Huh-7细胞自噬小体形成,上调Beclin1蛋白的表达水平,并促进了Beclin1在S93位点的磷酸化。
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