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研究背景与目的:胃肠外营养相关性胆汁淤积(parenteral nutrition associated cholestasis,PNAC)是新生儿胃肠外营养(parenteral nutrition,PN)最常见的并发症之一,长期接受PN的新生儿可出现PNAC,严重者可出现肝硬化、肝纤维化,甚至死亡,但PNAC的发病机制尚不清楚。我们前期在1例家族性胆汁淤积性患儿中发现Sema7A的R148W纯合子和杂合子突变均可导致胆汁淤积,并伴有明显的肝脏炎性损伤。Sema7A作为一个强有力的单个核细胞刺激因子,可诱导产生促炎反应,而肝脏的炎性损伤是胆汁淤积发生的关键因素;Sema7A还可通过与其受体β1整合素(ITGβ1)的相互作用,从而调节免疫和炎症功能。但在肝细胞内Sema7A是否能通过ITGβ1调节肝脏的炎性反应,进而促进新生儿PNAC发生发展,目前尚不清楚。因此我们利用基因过表达/干扰等现代分子生物学技术,研究Sema7A/ITGβ1/NF-κB信号通路在新生儿PNAC发病中的作用及机制。所得的实验结果不仅可以阐明新生儿PNAC发病的新机制,还可为新型治疗手段的研发提供新靶点。材料与方法:1.研究对象(1)2021年8月至2022年2月陆军军医大学第一附属医院儿科收治的行PN超过14d的新生儿23例,选取其中患PNAC的新生儿10例为PNAC组;采用随机数字表法从未出现PNAC的13例早产儿中随机抽取10例为对照组。(2)6~8周龄SPF级Sprague-Dawley雄性幼鼠(体质量220~240g)。(3)以胆汁酸盐刺激构建的体外肝kupffer细胞炎症损伤模型。2.研究方法(1)收集临床基本资料,根据患儿PN超过14天是否发生PNAC分为对照组和PNAC组,收集其外周血液,ELISA检测两组患儿血清中TNF-a、IL-1β、IL-4、IL-10及Sema7A表达情况,qRT-PCR检测外周血单个核细胞Sema7A、ITGβ1、P65 mRNA表达情况,Western-blot检测Sema7A、ITGβ1、IκBα、p-IκBα、P65、p-P65蛋白水平,免疫荧光检测Sema7A、ITGβ1、P65表达情况。(2)以30只雄性幼鼠随机分为3组(n=10)构建PNAC动物模型,14天后收集外周血液、肝脏及脾脏组织。全自动生化仪检测幼鼠肝功能,ELISA检测幼鼠血清及肝组织样本TNF-a、IL-1β、IL-4、IL-10及Sema7A表达,HE染色检测肝组织病理,油红O染色观察肝组织脂肪变性,免疫组化染色检测TNF-a、IL-10表达,qRT-PCR检测外周血单个核细胞和肝组织Sema7A、ITGβ1、P65 mRNA表达情况,Western-blot检测Sema7A、ITGβ1、IκBα、p-IκBα、P65、p-P65蛋白水平,免疫荧光检测Sema7A、ITGβ1、P65表达,流式细胞术检测幼鼠脾脏细胞中HLA-DR表达、淋巴细胞(CD4+、CD8+T)凋亡以及Treg细胞比例,并比较经内毒素诱导后单个核细胞产生TNF-α及用植物血凝素(PHA)刺激后淋巴细胞(CD4+T)产生IFN-γ的能力。(3)以体外灌注法原代分离和提取幼鼠肝kupffer细胞,以胆汁酸盐刺激构建体外kupffer细胞炎性损伤模型,分为:(1)TDCA组,TDCA+空载腺病毒组,TDCA+Sema7A-组,TDCA+Sema7A-+ITGβ1+组,TDCA+Sema7A-+ITGβ1++MG-132组,(2)TDCA组,TDCA+空载腺病毒组,TDCA+Sema7A+组,TDCA+Sema7A++ITGβ1-组。ELISA检测各组促炎细胞因子TNF-a、IL-1β、抗炎细胞因子IL-4、IL-10及Sema7A表达情况,qRT-PCR、Western-blot及免疫荧光检测每组Sema7A/ITGβ1/NF-κB变化情况。(4)以24只雄性幼鼠随机分为4组(n=6)构建PNAC模型,全自动生化仪检测幼鼠肝功能,ELISA检测幼鼠血清样本TNF-a、IL-1β、IL-4、IL-10及Sema7A表达,HE染色观察肝组织病理,油红O染色观察肝组织脂肪变性,免疫组化染色观察TNF-a、IL-10表达,在外周血单个核细胞和肝脏分别用qRT-PCR检测Sema7A、ITGβ1、P65 mRNA表达,Western-blot检测Sema7A、ITGβ1、IκBα、p-IκBα、P65、p-P65蛋白水平,免疫荧光检测Sema7A、ITGβ1、P65表达。3.统计学方法用SPSS 23.0统计软件对实验数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以平均数±标准差(X?S)表示,多组间的均数比较采用一元方差分析(One-Way ANOVA),均数之间的多重比较采用LSD法(方差齐)或者Tamhane方法(方差不齐)进行;变量之间的相关性采用Pearson相关检验,计数资料以(%)表示,进行?~2检验。P<0.05,差异有统计学意义。结果:1.两组患儿基线资料接近(P>0.05),与对照组比较,PNAC组直接胆红素及胆汁酸水平明显升高(P<0.05),外周血TNF-α、IL-1β表达明显增加,IL-4、IL-10表达减弱(P<0.05),外周血单个核细胞Sema7A、ITGβ1、P65 mRNA表达增强且Sema7A、ITGβ1、p-IκBα、p-P65蛋白水平增加(P<0.05),免疫荧光染色Sema7A、ITGβ1、P65的表达增强。2.与正常组及对照组比较,PNAC组幼鼠的ALT、AST、GGT及TBA水平升高,幼鼠血清、肝组织中TNF-α、IL-1β表达增加,IL-4、IL-10表达减弱(P<0.05);HE染色显示PNAC组幼鼠肝组织存在大量炎性细胞浸润;油红O染色显示PNAC组幼鼠肝组织存在大量脂质;免疫组化显示PNAC组幼鼠肝组织的TNF-a表达增加,而IL-10表达减弱;PNAC组幼鼠外周血单个核细胞及肝组织Sema7A、ITGβ1、P65 mRNA表达增加(P<0.05),Sema7A、ITGβ1、p-IκBα、p-P65蛋白水平增加(P<0.05),外周血单个核细胞及肝组织免疫荧光染色Sema7A和ITGβ1的表达以及Sema7A和P65的表达增强,TPN组幼鼠脾脏细胞HLA-DR表达降低(P<0.05),外周血Treg细胞的比例升高(P<0.05),经内毒素诱导产生TNF-α的细胞所占比例降低,而CD4+T淋巴细胞经PHA刺激后所产生IFN-γ的百分比TPN组明显减少(P<0.05),淋巴细胞(CD4+、CD8+T)晚期凋亡增多(P<0.05)。3.细胞实验中,干扰Sema7A表达后,TNFα、IL-1β生成减少(P<0.05),ITGβ1及P65表达减弱(P<0.05),IκBα及P65的磷酸化水平降低,但当同时过表达ITGβ1时其磷酸化水平有所升高(P<0.05),而在上述基础上干扰NF-κB则促炎因子及IκBα、P65的磷酸化水平均下降(P<0.05);相反,过表达Sema7A后TNFα、IL-1β生成增加(P<0.05),ITGβ1、P65表达以及IκBα、P65的磷酸化水平增加(P<0.05),但当同时抑制ITGβ1时IκBα、P65的磷酸化水平较前降低(P<0.05)。4.在Sema7A干扰和过表达PNAC大鼠模型中,当过表达Sema7A后ALT、AST、GGT、TBA、TBil、DBil、DBil/TBil水平增高(P<0.05),而抑制Sema7A表达则降低(P<0.05);当过表达Sema7A后促炎因子及ITGβ1、p-IκBα、p-P65的表达增强,肝脏炎性浸润增加,胆汁淤积程度加重,而当抑制Sema7A则炎性损伤降低,胆汁淤积程度减轻(P<0.05)。结论:1.通过临床新生儿血液样本及PNAC动物模型,证实肝脏炎性损伤是新生儿PNAC的重要表现。2.持续2周的TPN可导致幼鼠先天性及获得性免疫功能受损,促炎因子增加。3.Sema7A可通过与ITGβ1相互作用激活NF-κB通路,导致肝细胞炎性损伤。4.Sema7A/ITGβ1/NF-κB信号通路可能是新生儿PNAC发病机制之一,干预该信号通路可能是治疗新生儿PNAC的新靶点。