【摘 要】
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目的:探究宿主细胞蛋白TMED4对柯萨奇B组3型病毒（CVB3）复制的影响及机制。方法:1.分离提取原代心肌细胞:采用胰蛋白酶消化法和机械法相结合,从新生乳鼠心脏中分离出原代心肌细胞。并利用免疫荧光法对原代细胞进行鉴定。2.CVB3（MOI=5）感染原代心肌细胞和He La细胞不同时间点后,收集蛋白样品,Western blot检测CVB3感染不同时间后TMED4表达量的变化。3.构建pShutt
【基金项目】
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国家自然科学基金委（No.32060040）； 江西省自然科学基金委（20202BAB206062）；
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目的:探究宿主细胞蛋白TMED4对柯萨奇B组3型病毒（CVB3）复制的影响及机制。方法:1.分离提取原代心肌细胞:采用胰蛋白酶消化法和机械法相结合,从新生乳鼠心脏中分离出原代心肌细胞。并利用免疫荧光法对原代细胞进行鉴定。2.CVB3（MOI=5）感染原代心肌细胞和He La细胞不同时间点后,收集蛋白样品,Western blot检测CVB3感染不同时间后TMED4表达量的变化。3.构建pShuttle2-U6-TMED4-CMV-EGFP敲减质粒,转染He La细胞48 h,再用CVB3（MOI=5）感染细胞0、6、12 h后,分别收集总蛋白和总RNA,用Western blot和RT-q PCR检测CVB3结构蛋白VP1的表达水平。4.一步克隆法构建pcDNA3.1（-）-3Flag-TMED4过表达质粒,转染He La细胞,在TMED4过表达下,CVB3（MOI=5）感染0、6、12 h分别收集总蛋白和总RNA,用Western blot和RT-q PCR检测CVB3结构蛋白VP1的表达水平,用病毒空斑实验检测TMED4对CVB3病毒滴度的影响。5.CVB3（MOI=5）感染TMED4过表达或敲减的He La细胞0、6、12 h后分别收集总RNA,利用RT-q PCR分别检测Ι型干扰素信号通路相关基因TLR4、MDA5、TRIF、TRAF3、MAVS、IKKi、IRF3、IFN-α、IFN-β和ISG15的表达。6.明确与TMED4相互作用的CVB3病毒蛋白:构建以pcDNA3.1（-）-3Flag为载体的携带CVB3病毒各组分基因的质粒,主要包括:结构蛋白基因VP1-VP4和部分非结构蛋白基因（2A、2C、3A、3D、2B、3B和3C）。将以上质粒分别和pcDNA3.1（-）-3HA-TMED4质粒共同转染293T细胞,利用细胞内免疫共沉淀筛选与TMED4相互作用的CVB3病毒蛋白。7.构建rAd-3A重组腺病毒:以CVB3病毒RNA为模板,逆转录为c DNA,扩增3A基因。首先构建pCAG-2Strep-Flag-3A重组质粒,然后以此质粒为模板扩增Flag-3A融合片段。将此基因构建至pAd Track-CMV载体中,利用电击法转化至BJ5183感受态中形成pAd Track-CMV-Flag-3A-Adeasy-1重组腺病毒质粒。重组腺病毒质粒在293A细胞中经过包装后形成rAd-3A重组腺病毒,并进行滴度检测。8.rAd-3A重组腺病毒感染原代心肌细胞和He La细胞,利用Western blot检测3A蛋白对TMED4表达量的影响。结果:1.CVB3可在原代心肌细胞和He La细胞中复制增殖,同时可降低细胞中TMED4的表达量;2.成功构建pcDNA3.1（-）-3Flag-TMED4过表达质粒和pShuttle2-U6-TMED4-CMV-EGFP敲减质粒;3.敲减TMED4的He La细胞经CVB3感染后,相对于被CVB3感染的正常He La细胞,可以增强CVB3病毒结构蛋白VP1在He La细胞中的表达,升高CVB3滴度;而TMED4过表达可以减弱CVB3病毒结构蛋白VP1在He La细胞中的表达,降低病毒滴度;4.敲减TMED4的He La细胞经CVB3感染后,相对于被CVB3感染的正常He La细胞,其Ι型干扰素信号通路可被抑制,造成TLR4、MDA5、TRIF、TRAF3、MAVS、IKKi、IRF3、IFN-α、IFN-β和ISG15表达的降低;而TMED4过表达则可以上调Ι型干扰素信号通路,促进TLR4、MDA5、TRIF、TRAF3、MAVS、IKKi、IRF3、IFN-α、IFN-β和ISG15的表达;5.细胞内免疫共沉淀证实TMED4与CVB3非结构蛋白3A的直接相互作用具有唯一性,TMED4与CVB3其他蛋白不存在相互作用;6.成功构建和包装rAd-3A重组腺病毒,rAd-3A感染原代心肌细胞和He La细胞后可降低TMED4的表达。结论:1.CVB3通过非结构蛋白3A降低细胞内TMED4的表达,使病毒复制增殖;2.宿主细胞可能通过TMED4/TLR4/IKKi或者TMED4/MDA5/MAVS介导的Ι型干扰素信号通路抑制CVB3病毒复制。
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