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贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）是人畜共患病Q热的病原体,又称Q热立克次体,现归属于军团菌目柯克斯体科柯克斯体属,在其体外培养技术发明之前一直被认为是专性胞内寄生菌。C.burnetii主要通过气溶胶途径在人与动物间传播,且感染量极低。人感染C.burnetii后通常表现为流感样症状,伴有乏力高热等体征,多数情况下可自愈,但也可引发慢性和持续性感染,表现为肝炎、心内膜炎等症状,甚至死亡。C.burnetii也可感染家畜,造成畜牧业损失的同时也成为人的传染源。因此加强C.burnetii致病机制的研究,有助于为Q热的预防和控制提供新的思路和启示,具有重要意义。C.burnetii主要感染肺泡巨噬细胞,并在其内大量增殖。在感染期间C.burnetii可在宿主细胞内形成巨大的寄生囊泡,研究发现随着CCV的不断增大,细胞的自噬体也不断与CCV发生融合,CCV利用与自噬体的融合为C.burnetii扩大生存空间和提供生长所需的营养。同时促进细胞自噬也可促进C.burnetii的胞内生长,提示细胞自噬在C.burnetii感染中发挥的重要作用。C.burnetii在感染期间通过其Ⅳ型分泌系统分泌多种效应蛋白到宿主细胞质中,参与调控包括细胞自噬、凋亡等多种宿主细胞生命进程,为自身的感染和增殖提供有利的环境。质粒Qp H1是C.burnetii重要的毒力因子,其上编码多种效应蛋白。CpeB是质粒Qp H1上的基因cbua0013编码的效应蛋白,研究提示CpeB可能是质粒Qp H1上重要的效应蛋白,在C.burnetii胞内增殖中发挥着重要作用。因此本研究围绕效应蛋白CpeB展开,首先构建了CpeB的真核表达载体,探究了CpeB对细胞自噬水平的影响;然后以质粒Qp H1为模板构建穿梭载体,利用质粒相似不兼容原理构建了C.burnetii质粒缺失株和仅表达CpeB的质粒缺失株,通过检测不同菌株感染细胞和SCID小鼠后表型和毒力水平的差异,初步明确了效应蛋白CpeB的生物学功能;最后通过免疫共沉淀和共聚焦显微镜确认了CpeB与宿主蛋白Rab11a之间的相互作用,并探究了其相互作用的结构域以及Rab11a对贝氏柯克斯体感染和胞内生存的影响;此外还在实验室先前的研究基础上进一步研究了重要自噬调控蛋白ATG4B对C.burnetii胞内生存的影响。通过检测C.burnetii感染细胞后1～7 d蛋白表达水平,发现细胞被C.burnetii感染后自噬处于持续激活的状态。用巴佛洛霉素-A1或雷帕霉素处理感染了C.burnetii的细胞,结果发现促进自噬有利于C.burnetii的胞内生存,而抑制自噬则抑制了其胞内生存,提示细胞自噬在C.burnetii胞内增殖中发挥着重要作用。在Hela细胞过表达CpeB,利用GFP-LC3单荧光指示系统和Western blotting实验检测CpeB对细胞自噬的影响,结果显示CpeB过表达后细胞内GFP-LC3荧光呈明显聚集的点状分布,其荧光斑点的计数结果远高于对照组;且过表达CpeB后细胞LC3-Ⅱ的表达水平显著提高,说明了CpeB能够促进细胞自噬。通过参考国内外已有的遗传学操作方法,设计C.burnetii质粒穿梭载体并获得C.burnetii质粒缺失株（NMⅡpQGK）和仅表达CpeB的质粒缺失菌株（NMⅡpQGK-cpe B）进行细胞感染实验。结果发现与野生株C.burnetii相比,NMⅡpQGK感染细胞后细胞的自噬水平明显降低,菌株在THP-1细胞中的生长水平也显著下降;而NMⅡpQGK-cpe B感染细胞后细胞的自噬水平和胞内生存水平出现了一定的回升,表明CpeB可能通过促进细胞自噬进而促进C.burnetii的胞内生存。与野生株C.burnetii感染细胞后形成大CCV不同,NMⅡpQGK感染THP-1细胞后形成的CCV呈现出多而小的特点;NMⅡpQGK-cpe B菌株可以在一定程度上回补质粒缺失引起的细胞自噬和菌株胞内生长水平的降低,但却无法回补CCV同源融合的缺陷。在SCID小鼠感染实验中我们发现相比于野生株C.burnetii,NMⅡpQGK感染后的小鼠肝肿大、脾肿大水平下降,肝脏和脾脏的菌载量也有显著的下降;而NMⅡpQGK-cpe B的毒力则出现了一定的回升,说明表达CpeB可以在一定程度上回补质粒缺失所造成的C.burnetii毒力的下降。提示CpeB影响C.burnetii在SCID小鼠感染模型中的毒力,是C.burnetii重要的毒力因子。接下来对效应蛋白CpeB与宿主蛋白的相互作用进行了深入研究。通过亲和纯化串联质谱技术发现C.burnetii质粒效应蛋白CpeB可能与宿主自噬相关蛋白Rab11a存在相互作用。通过免疫共沉淀实验和激光共聚焦显微镜对其相互作用进行了验证。然后通过构建截短体和免疫共沉淀实验探究其相互作用的结构域,发现Rab11a与CpeB相互作用的结构域位于Rab11a第113-216位氨基酸和CpeB第164-204位氨基酸之间。对其相互作用的模式进行探究时发现CpeB的表达并不影响Rab11a的表达水平,并且不以GTP酶活化蛋白或鸟苷酸交换因子的形式影响Rab11a的酶活性,其相互作用的方式尚待进一步研究证明。同样利用GFP-LC3单荧光指示系统和Western blotting实验检测Rab11a对细胞自噬的影响,发现Rab11a的表达水平与LC3-Ⅱ表达水平密切相关,敲低或过表达Rab11a分别抑制或促进C.burnetii的胞内生长,提示宿主蛋白Rab11a对C.burnetii的胞内生长的影响很可能与细胞自噬有关。为进一步研究CpeB与Rab11a的相互作用对细胞自噬的影响,我们在过表达CpeB的基础上敲低Rab11a的表达水平,结果发现敲低Rab11a部分抵消了由过表达CpeB所引起的细胞自噬水平的升高,说明效应蛋白CpeB对细胞自噬的促进部分依赖于宿主蛋白Rab11a。最后构建Rab11a基因条件性敲除的C57BL6J小鼠(Rab11a-/-CKO),以气溶胶肺递送的形式进行C.burnetii感染实验,结果发现C.burnetii在Rab11a-/-CKO小鼠中毒力减弱,具体表现为脾肿大水平和脾菌载量、肺菌载量的显著下降,肺部病理变化明显减轻。这些结果说明效应蛋白CpeB可与宿主蛋白Rab11a之间发生相互作用,并且在C.burnetii感染宿主后的增殖过程中发挥着重要作用,CpeB对细胞自噬水平的促进作用则部分依赖于Rab11a。实验室前期的研究结果表明ATG4B表达水平的降低可能影响了C.burnetii的胞内生存,本次在ATG4B影响C.burnetii胞内生存研究中我们通过进一步设计多条ATG4B特异的si RNA,并选择了其中抑制ATG4B效率最高的si RNA进行实验。发现敲低ATG4B的表达可以在一定程度上阻断细胞自噬流,并且抑制C.burnetii的胞内生存和CCV的同源融合,提示ATG4B在C.burnetii胞内生存中发挥了重要作用。综上所述,本研究对C.burnetii质粒效应蛋白CpeB调节细胞自噬的机制和ATG4B在C.burnetii胞内生存中的重要作用进行了初步探索。明确了效应蛋白CpeB可以促进细胞自噬,在细胞和SCID小鼠感染模型中证明了CpeB是C.burnetii质粒上重要的毒力因子。宿主蛋白Rab11a为效应蛋白CpeB的宿主互作靶点,其相互作用结构域位于Rab11a第113～216位氨基酸CpeB第164～204位氨基酸之间。宿主蛋白Rab11a不仅能够诱导细胞自噬,促进C.burnetii胞内生长,并且CpeB对细胞自噬的促进作用部分依赖于Rab11a的表达。最后还证明宿主蛋白ATG4B在C.burnetii胞内生存和CCV同源融合中发挥重要功能。本研究进一步揭示了自噬在C.burnetii感染和增殖过程中的重要作用,为Q热感染的预防与治疗提供了新的理论基础和思路。