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研究背景:山茄子（Brachybotrys paridiformis Maxim.ex Oliv.）,属于紫草科附地菜族山茄子属植物,广泛分布于我国东北地区,繁殖能力旺盛,对生长环境要求较低。研究表明山茄子中氨基酸和微量元素含量丰富,具有一定的抗炎活性和丰富的抗氧化成分,无论在食品、保健食品,还是药品研发方面均具有很好的研究价值和开发潜力。本课题主要对山茄子中的化学成分及其抗乙肝病毒活性进行研究。实验目的:1.通过建立科学有效的实验方法和合理的数据模型,确定山茄子地上部分提取工艺。2.对山茄子地上部分进行提取、分离、纯化并对所得单体化合物进行结构鉴定,总结山茄子中的主要化合物类型,期望分离出未被报道过的化合物。3.探究山茄子分离组分及单体成分的抗乙肝病毒活性,筛选主要活性成分,并对其构效关系进行阐述。实验方法:1.山茄子提取工艺研究:在查阅文献的基础上,确定以迷迭香酸为对照品,高效液相色谱法为测定方法,利用单因素试验结合响应面设计方法对乙醇浓度、液料比、提取时间、提取次数四种提取因素进行考察,以迷迭香酸提取率为评价指标,对山茄子地上部分提取工艺进行优化。2.山茄子中化学成分的提取、分离、纯化及结构鉴定:根据优化后的提取工艺条件,对山茄子干燥地上部分进行提取。将山茄子干燥地上部分用52%乙醇溶液（液料比18:1）室温冷浸3次,每次3天,收集合并滤液,减压干燥得浸膏。将所得浸膏溶于蒸馏水,减压过滤,滤液通过D101大孔树脂柱色谱法初步分离,收集30%及50%乙醇洗脱组分,进一步通过硅胶柱层析及半制备高效液相色谱法分离纯化,得到单体化合物。通过化学方法以及谱学数据（一维和二维核磁共振波谱、高分辨质谱、气相色谱、旋光度检测及圆二色谱法）解析化合物结构。3.山茄子分离组分及单体化合物抗乙肝病毒（HBV）活性研究:以拉米夫定为阳性药,MTT法检测30%、50%洗脱组分以及各单体化合物对Hep G 2.2.15细胞活力的影响;ELISA法检测其对乙肝病毒表面抗原（HBs Ag）、e抗原（HBe Ag）的分泌抑制作用,总结活性化合物的构效关系并筛选最优活性化合物。最后采用实时荧光定量PCR法检测最优活性化合物对HBV-DNA的复制及HBs m RNA、HBe m RNA、HBV pg RNA表达水平的影响。实验结果:1.综合分析单因素及响应面法试验结果,得到山茄子地上部分最佳提取工艺条件为:采用浓度为52%的乙醇溶液以18:1的液料比提取3次,每次3天。2.从山茄子地上部分分离纯化并鉴定出50个单体化合物,其中47个从山茄子中首次得到,化合物5、19、21、24、26、27、30、38、41、48、49为新化合物。11个新化合物结构分别为:brachnan A:2R-3-（3,4-二羟基-苯基）-2-[（3-甲氧基-4-羟基-苯基）-6,7-二羟基-3-萘甲酰基-氧基]-丙酸（5）;brach acid A:2R-[[（2E）-3-（3,4-二羟基-苯基）-1-氧代-2-丙烯基]氧基]-3-（2-甲酰基-4,5-二羟基-苯基）丙酸（24）;brach acid B:2-羟基-5-O-β-D-[6-（E）-2-甲基-2-丁烯酸-吡喃葡萄糖基]苯甲酸（38）;brachoside A:3-O-阿魏酰基-6′-O-（4-O-α-L-吡喃鼠李糖香豆酰基）蔗糖（27）;brachoside B:（7R,8S,7′E）-3,3′-二甲氧基-7′-甲酰乙烯基-4′,7-环氧-8,5′-新木脂素-4,9-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（41）;brachoside C:丁香酚-4-O-β-D-吡喃葡萄糖-（2→1）-β-D-吡喃葡萄糖苷（30）;brachoside D:（7S,8R,7′E）-7,9-二羟基-3,3′-二甲氧基-8-O-4′-新木脂素-7′-甲酰乙烯基-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（26）;brachin A:3f→2a:6f→3a-[（3S,4R）-4′,7-二羟基-3′,6-二甲氧基-4,10-环木脂素-1-烯-2a,3a-二羰基]蔗糖（21）;brachin B:3f→2a:6f→3a-[（3S,4R）-4′,7-二羟基-3′,6-二甲氧基-4,10-环木脂素-1-烯-2a,3a-二羰基]-6g-（4′′-（1r-α-L-吡喃鼠李糖基-对香豆酰基））蔗糖（48）;brachin C:3f→2a-[（3S,4R）-4′,7-二羟基-3′,6-二甲氧基-4,10-环木脂素-1-烯-2a,3a-二羰基]-6g-（4′′-（1r-α-L-吡喃鼠李糖基-对香豆酰基））蔗糖（49）;brachin D:3f→2a:6g→3a-[（3R,4R）-4′,7-二羟基-3′,5,6-三甲氧基-4,10-环木脂素-1-烯-2a,3a-二羰基]蔗糖（19）。3.除已有文献报道的6个抗HBV活性化合物外,共筛选出山茄子30%、50%洗脱组分以及7个单体化合物具有显著的抗乙肝病毒活性,其中咖啡酸酐活性较强且含量较高,因此对其进行进一步探究。实验得出咖啡酸酐能够显著抑制HBs Ag、HBe Ag分泌和HBV-DNA复制且具有剂量依赖性关系。76μM咖啡酸酐9天HBs Ag抑制率为55.06%,高于阳性药拉米夫定（11.38%）;HBe Ag抑制率为22.80%,,高于阳性药拉米夫定（3.53%）。38μM咖啡酸酐6天HBV-DNA抑制率为58.12%,略低于阳性药拉米夫定（67.23%）。另外,38μM咖啡酸酐能够显著抑制Hep G 2.2.15细胞中HBs m RNA、HBV pg RNA含量（P＜0.05）,对HBe m RNA的含量无显著性影响。实验结果表明咖啡酸酐的抗乙肝病毒活性机制可能与降低HBs m RNA、HBV pg RNA表达水平有关。结论:1.单因素和响应面法试验设计优化山茄子地上部分提取工艺,试验科学合理,试验结果可用于后续实验的进行。2.从山茄子地上部分分离并鉴定出50个单体化合物,其中新化合物有11个。通过分析其结构总结出这些化合物类型主要为苯丙素及其衍生物,为山茄子的后续研究提供化合物基础。3.体外抗乙肝病毒活性实验结果表明山茄子30%、50%乙醇洗脱组分具有显著HBV抗原抑制作用,具有开发成抗乙肝病毒药物的可能性。对除（7R,8S）-balanophonin外的抗乙肝病毒活性单体结构进行总结,发现其共同点是均含有一个及以上3,4-二羟基苯基团,推测这可能是这类化合物抗乙肝病毒活性的关键基团。单体化合物中咖啡酸酐抗乙肝病毒活性最强,其机制可能与降低HBs m RNA、HBV pg RNA表达水平有关。